發(fā)布時間：2014-12-23 10:51

 

【摘要】 日本沼蝦隸屬十足目、長臂蝦科、沼蝦屬，自然分布于中國、日本、越南及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，在我國各地淡水水域中都有分布。日本沼蝦的養(yǎng)殖始于二十世紀(jì)五十年代，從2004年起，我國日本沼蝦的年養(yǎng)殖產(chǎn)量就超過了20萬噸。多年來，日本沼蝦在市場上一直供不應(yīng)求，暢銷不衰，是一種養(yǎng)殖效益非常可觀的淡水蝦類。但長期以來，繁殖日本沼蝦用的親本多為野生個體，未經(jīng)過系統(tǒng)選育，日本沼蝦的養(yǎng)殖單產(chǎn)較低，且多是套養(yǎng)在各種魚類的養(yǎng)殖池塘中，主養(yǎng)日本沼蝦的池塘較少。因此開展日本沼蝦的種質(zhì)資源保護(hù)、良種選育工作是當(dāng)前日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)中亟待解決的問題。由于當(dāng)前已知的日本沼蝦微衛(wèi)星標(biāo)記只有二十多個，這嚴(yán)重地限制了日本沼蝦的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源評價等工作；此外，日本沼蝦雄性生長速度顯著大于雌性，開展單性苗種培育意義重大，但當(dāng)前沒有鑒別日本沼蝦遺傳性別的分子標(biāo)記，使得單性苗種培育工作一直無法得以開展。本論文的研究內(nèi)容主要包含如下3個方面：1.日本沼蝦多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)：（1）FIASCO法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。通過生物素標(biāo)記的探針（GT）13和（GA）13富集微衛(wèi)星序列，共獲得含微衛(wèi)星的序列334個，成功設(shè)計引物110對，設(shè)計引物的序列含有的微衛(wèi)星重復(fù)多為2堿基重復(fù)，重復(fù)數(shù)多數(shù)在10次以上。設(shè)計的引物擴(kuò)增的目的條帶大小在95-356bp之間。多態(tài)性分析顯示，24對引物擴(kuò)增出的條帶為清晰穩(wěn)定的多態(tài)，開發(fā)效率（多態(tài)性引物占總設(shè)計引物的百分比）為21.8%。各位點(diǎn)等位基因數(shù)介于2-9之間，各等位基因的大小范圍在111-334bp之間；各位點(diǎn)期望雜合度（He）在0.1905-1.0000之間，各位點(diǎn)的觀測雜合度（Ho）在0.1765-0.8090之間，除個別位點(diǎn)外（X781、X63、Z339）期望雜合度（He）與觀測雜合度（Ho）均在0.3以上；各等位基因的多態(tài)信息含量（PIC）在0.1574-0.8272之間，其中X781與Z339兩個位點(diǎn)的PIC值在0.25以下，屬于低度多態(tài)性位點(diǎn)；X195等5個位點(diǎn)的PIC值在0.25與0.5之間，屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)；其余的17個位點(diǎn)的PIC值皆大于0.5，屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)。經(jīng)Bonferroni法校正（P <0.003）后，24個多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中有9個微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了Hardy–Weinberg平衡，其中有2個位點(diǎn)（X1214、Z167）表現(xiàn)出顯著的雜合子缺失（Hardy–Weinberg平衡偏離指數(shù)D<0，D=(Ho-He)/He），其他7個位點(diǎn)表現(xiàn)出顯著的雜合子過剩（Hardy–Weinberg平衡偏離指數(shù)D>0）。（2）ISSR-PCR法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。設(shè)計的8對簡并引物中用于擴(kuò)增CA/GT重復(fù)單元的引物PCA6、PGT6、PTG6、PAC6能夠擴(kuò)增出亮度較大的彌散帶，將這四對簡并引物克隆后測序。將前人已經(jīng)開發(fā)出的微衛(wèi)星同源序列去除后，共獲得含微衛(wèi)星的序列114個，成功設(shè)計引物45對。多態(tài)性分析顯示，23對引物擴(kuò)增條帶為多態(tài)，開發(fā)效率為51.1%。各位點(diǎn)等位基因數(shù)介于2-12之間；各等位基因的大小范圍在141-324bp之間；各位點(diǎn)期望雜合度（He）在0.2357-1.0000之間，各位點(diǎn)的觀測雜合度（Ho）在0.3203-0.9169之間；各等位基因的多態(tài)信息含量（PIC）在0.2894-0.8877之間，其中4個位點(diǎn)（B78、B96、B75、D30）PIC值在0.25-0.5之間，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，其他位點(diǎn)的PIC值都大于0.5，屬于高度多態(tài)位點(diǎn)。經(jīng)Bonferroni法校正(P <0.003)后，23個多態(tài)性位點(diǎn)中6個微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了Hardy–Weinberg平衡，其中有三個位點(diǎn)（B96、B73、B92）表現(xiàn)出顯著的雜合子缺失（Hardy–Weinberg平衡偏離指數(shù)D<0，D=(Ho-He)/He），另外三個位點(diǎn)（A89、 B75、 C2）表現(xiàn)出顯著的雜合子過剩（Hardy–Weinberg平衡偏離指數(shù)D>0）。（3）微衛(wèi)星序列特征分析對391條含微衛(wèi)星重復(fù)的序列進(jìn)行統(tǒng)計分析（圖3-7），發(fā)現(xiàn)獲得的微衛(wèi)星序列長度范圍在60-852bp之間，100bp以下的最少（16個）。大部分克隆片段大小在200bp以上，占總序列的83.1%。日本沼蝦的微衛(wèi)星序列中以二核苷酸重復(fù)最為豐富，占所有微衛(wèi)星序列類型數(shù)目的92.4%，其次是三核苷酸（1.8%）或四核苷酸重復(fù)(1.6%)。二核苷酸重復(fù)中以（CA/GT）n類型所占比例最高，占總微衛(wèi)星序列數(shù)的68.3%，其次是（GA/CT）n型，占25.1%，此外還有少量的（TA/AT）n型和（GC/CG）n型，分別占2.8%和0.6%。2.4個日本沼蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)分析利用8個微衛(wèi)星標(biāo)記（A28、A73、B13、B29、B44、B93、D7、Z337）對太湖、東平湖、微山湖、長江下游（崇明島附近水域）4個群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，4個群體中長江下游（崇明島附近水域）群體的平均等位基因數(shù)最多，為13.5000，其次是微山湖群體為12.2500，太湖群體最低為11.87。微山湖群體的平均期望雜合度和觀測雜合度最高，分別為0.8403和0.8350；長江下游（崇明島附近水域）群體的最低，分別為0.7145和0.7909。各群體間遺傳距離分析顯示，微山湖和東平湖群體的遺傳距離最小，為0.0158；長江下游（崇明島附近水域）和微山湖的遺傳距離最大為0.3844。各群體間的遺傳相似度分析也得出了類似的結(jié)果，微山湖和東平湖的遺傳相似度最大（0.9162）；長江下游（崇明島附近水域）和微山湖的遺傳相似度最�。�0.6312）�；谶z傳距離的NJ和UPGMA聚類分析得到了相同的結(jié)果，東平湖群體和微山湖群體遺傳距離最小首先聚類為一支，再與太湖群體聚為一支，最后和長江下游（崇明島附近水域）群體聚類為一支。聚類分析的情況和實(shí)際的地理距離相符。4個日本沼蝦群體的分子方差分析（AMOVA）顯示，群體中89.29%的變異來源于個體內(nèi)，僅有4.18%的變異來源于群體間，6.52%來源于群體內(nèi)個體間，顯著性檢驗(yàn)分析顯示這4個群體遺傳分化極顯著（P <0.01）。4個群體兩兩間遺傳分化指數(shù)Fst從0.0031到0.0739，其中東平湖群體與長江下游（崇明島附近水域）群體、微山湖群體與長江下游（崇明島附近水域）群體的0.05<Fst <0.15，屬于中等分化程度；其他群體間的Fst值均<0.05，分化程度較弱。日本沼蝦群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析對其種質(zhì)資源保護(hù)和合理挖掘利用具有重要意義。（3）性別相關(guān)標(biāo)記的篩選：在利用15雌和15雄日本沼蝦對開發(fā)的47個微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析時，我們發(fā)現(xiàn)有8個SSR標(biāo)記出現(xiàn)了雌性或雄性特異的等位基因。為此，我們合成了這8個微衛(wèi)星標(biāo)記的上游熒光引物，利用熒光SSR法，對另外的15雌和15雄日本沼蝦進(jìn)一步進(jìn)行分析、驗(yàn)證。結(jié)果顯示，有7個微衛(wèi)星標(biāo)記檢測到了雌性或雄性特異的等位基因（等位基因出現(xiàn)次數(shù)在2次以上）。首先利用2個雌性個體和2個雄性個體對64對AFLP引物的擴(kuò)增情況進(jìn)行了篩選，對其中的9對引物進(jìn)一步利用15個雌性個體和15個雄性個體進(jìn)行大量分析。有8對檢測到分布頻率雌雄差異顯著的等位基因，其中雄性占絕大多數(shù)（90.9%）的等位基因有1個，雌性占絕大多數(shù)（84.6%）的等位基因有2個，可為日本沼蝦性別決定機(jī)制研究提供參考。 

1. 引言

 

1.1 分子標(biāo)記技術(shù)簡介

1.1.1 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）標(biāo)記
RFLP 即限制性片段長度多態(tài)性，是 20 世紀(jì) 80 年代發(fā)展起來的以 DNA-DNA 雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標(biāo)記（Bostein 等，1980），Dodgson 等（1997）認(rèn)為其打響了基因組革命的第一槍，標(biāo)志著生物科學(xué)進(jìn)入了一個全新的時代。其基本原理是基因組DNA 由一種或者多種限制性內(nèi)切酶識別并切割后產(chǎn)生具有長度差異的 DNA 片段，所產(chǎn)生的 DNA 數(shù)目和各個片段的長度反映了 DNA 分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況�；蚪M DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，可在瓊脂糖膠上進(jìn)行分離。為便于進(jìn)一步分析，電泳分離已經(jīng)經(jīng)過內(nèi)切酶消化過的這些片段，轉(zhuǎn)移到固體載體如硝酸纖維素膜或者尼龍膜上。然后用標(biāo)記的 DNA 片段作為探針與目的片度進(jìn)行雜交，雜交后洗脫非特異性探針，只留下與特定位點(diǎn)雜交結(jié)合的探針。將膜置于放射性自顯儀下觀測差異的條帶。

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1.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)分離方法
相比其他的分子標(biāo)記，微衛(wèi)星憑借其多態(tài)性高、呈孟德爾式遺傳（共顯性）、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，受到遺傳學(xué)家的重視，被迅速用于遺傳連鎖圖譜的建立、種質(zhì)鑒定、群體遺傳學(xué)研究以及種群結(jié)構(gòu)研究等方面。但是開展微衛(wèi)星標(biāo)記相關(guān)研究時，首先要獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列信息，并根據(jù)其側(cè)翼保守序列設(shè)計微衛(wèi)星引物。目前，常用的分離微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法主要有：（1）傳統(tǒng)方法（2）微衛(wèi)星富集法（3）數(shù)據(jù)庫查找法（4）近緣物種篩選法（5）FIASCO法

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2、材料與方法

 

2.1 試驗(yàn)用日本沼蝦

本試驗(yàn)用于開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記和多態(tài)性分析的日本沼蝦于 2009 年 8 月，捕自高樓鄉(xiāng)附近的微山湖中，共采集 60 只（圖 2-1），活的日本沼蝦運(yùn)至泰安后，解剖取肌肉保存于 95%酒精中或直接將肌肉冷凍在-20℃冰箱中。

本試驗(yàn)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的日本沼蝦共從 4 個地點(diǎn)采集：太湖日本沼蝦群體采自太湖靠近無錫淡水漁業(yè)研究中心水域，共采集 90 只；東平湖日本沼蝦群體捕自東平湖，共采集 30 只；微山湖日本沼蝦群體捕自微山湖中，筆耕文化傳播，共采集 45 只；長江下游（崇明島附近水域）日本沼蝦群體 40 只從長江下游崇明島附近水域中采集（表 2-1）。

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2.2 試劑和儀器
Tris 堿、EDTA、氯化鈉、氫氧化鈉、甲醇、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、親和硅烷、剝離硅烷、碳酸氫鈉等生化試劑購自 Promega 公司和天根生物有限公司。磁珠購自 Promega 公司；生物素探針、pBR322/MspI 分子量標(biāo)記、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、DNA 連接試劑盒購自天根生物有限公司；TaqDNA 聚合酶、RNase A、dNTPs 購自 Takara 生物工程有限公司； MseI 內(nèi)切酶購自NEB 公司；微衛(wèi)星建庫用的接頭、T3 和 T7 引物、微衛(wèi)星引物、MseI-N 引物由上海生物工程有限公司合成。IRDye  Fluorescent AFLP  Kit for Large Plant Genome Analysis試劑盒購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

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3、結(jié)果.............................. 34
3.1 FIASCO 法開發(fā)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記..................... 34
3.2 ISSR-PCR 法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)果.................................. 42
3.3 開發(fā)的微衛(wèi)星序列特征分析 ..................... 48
3.4 4 個日本沼蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 ....................... 50
3.5 日本沼蝦性別相關(guān)分子標(biāo)記篩選......................... 57
4.討論............................... 64
4.1 微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā) ........................ 64
4.2 微衛(wèi)星二核苷酸的重復(fù)類型 ......................... 67
4.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 ................68

4.4 性別相關(guān)分子標(biāo)記 .................... 70

 

4.討論

 

4.1 微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)

4.1.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的分離方法

大量分離鑒定微衛(wèi)星標(biāo)記的最簡單的方法是構(gòu)建小片段微衛(wèi)星的富集文庫（Orsrander 等，1992；Lyall 等，1993；Kijas 等，1994；Zane 等，2002）。構(gòu)建富集文庫的方法有很多種，例如選擇性雜交法（尼龍膜富集法和磁珠富集法）、RAPD 富集法、ISSR-PCR 法、FIASCO 法等。富集微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法通常包含用含串聯(lián)重復(fù)序列的探針與適當(dāng)酶切的基因組 DNA 片段進(jìn)行選擇性雜交，再通過 PCR 擴(kuò)增相關(guān)的片段。在各種富集方法中，尤其以 FIASCO法應(yīng)用的最為廣泛。在本研究中，應(yīng)用 FIASCO 法開發(fā)微衛(wèi)星位點(diǎn)時，共獲得含微衛(wèi)星的序列 337個，其中成功設(shè)計引物 110對（占總序列的 32.6%），最終成功獲得多態(tài)性微衛(wèi)星引物24 對，開發(fā)效率（即多態(tài)性引物占總設(shè)計引物的百分比）為 21.8 %。這與其他研究者用該法分離水生生物的微衛(wèi)星時得到的開發(fā)效率相類似.

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5.結(jié)論

 

本論文的研究結(jié)果總結(jié)如下：
1.日本沼蝦多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)
本論文通過 FIASCO 法和 ISSR-PCR兩種方法開發(fā)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，共挑選 835個陽性克隆進(jìn)行測序，成功獲得序列 448 條，其中不含微衛(wèi)星重復(fù)序列的有 57 個，含微衛(wèi)星重復(fù)序列的有 391個，占全部序列總數(shù)的的 87.3%。用 FIASCO 法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，共獲得含微衛(wèi)星的序列 334 個，成功設(shè)計引物110 對， 24 對引物擴(kuò)增出的條帶為清晰穩(wěn)定的多態(tài)，開發(fā)效率（多態(tài)性引物占總設(shè)計引物的百分比）為 21.8%。用 ISSR-PCR 法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，共獲得含微衛(wèi)星的序列114 個，成功設(shè)計引物 45 對。多態(tài)性分析顯示，23 對引物擴(kuò)增條帶為多態(tài)，開發(fā)效率為 51.1%。

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本文編號：10830