本文關(guān)鍵詞：三葉青擴(kuò)展蛋白基因的克隆和塊根內(nèi)生真菌的分離鑒定及其分析

  更多相關(guān)文章： 三葉青 擴(kuò)展蛋白 內(nèi)生真菌 塊根 黃酮

【摘要】：三葉青(Tetrastigma hemsleyanum Diels Gilg ex Diels)為我國(guó)珍稀藥用植物,全株均可入藥,以球形塊根藥用價(jià)值最高；但自然條件下三葉青生長(zhǎng)緩慢,目前已無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求。擴(kuò)展蛋白是一類(lèi)普遍存在于植物細(xì)胞壁的蛋白質(zhì),不僅可以使細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng),而且可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁柔韌性使其適應(yīng)周?chē)h(huán)境;植物內(nèi)生真菌在自然界廣泛存在,且種類(lèi)繁多,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,內(nèi)生真菌與宿主植物形成互惠互利的關(guān)系,內(nèi)生真菌既可以影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育,又可以提高植物的抗旱、抗鹽、抗病等抗逆性,并且對(duì)宿主植物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生具有影響作用。本研究首先克隆了三葉青擴(kuò)展蛋白基因(Th-exp)全長(zhǎng)cDNA序列；其次,分離鑒定了三葉青塊根中的內(nèi)生真菌并進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察；最后,測(cè)定了接種內(nèi)生真菌發(fā)酵液的三葉青無(wú)菌苗中擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)量以及藥用活性成分總黃酮的含量。具體研究結(jié)果如下：(1)根據(jù)GenBank中登錄的擴(kuò)展蛋白基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物,以三葉青球形塊根cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再結(jié)合RACE技術(shù),獲得三葉青擴(kuò)展蛋白基因全長(zhǎng)cDNA序列(命名為T(mén)h-exp),共782 bp,其中包含630 bp開(kāi)放閱讀框,編碼209個(gè)氨基酸(序列已被GenBank收錄,登錄號(hào)KP693606)。Th-exp編碼的蛋白質(zhì)具有典型的擴(kuò)展蛋白結(jié)構(gòu)特征,N端含有8個(gè)半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域,C端含有4個(gè)保守的色氨酸結(jié)構(gòu)域,中間含有組氨酸功能域。Blast分析顯示,Th-exp與葡萄、醉蝶花中擴(kuò)展蛋白基因具有相似性。半定量RT-PCR和熒光定量PCR分析表明,Th-exp基因在三葉青葉、莖、普通細(xì)根和球形塊根中均有表達(dá),但球形塊根中表達(dá)強(qiáng)于其它器官。(2)采用組織塊分離法,從三葉青多年生塊根中共分離到31株內(nèi)生真菌,菌株顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)速度等具有差異性。通過(guò)對(duì)內(nèi)生真菌的ITS rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增和分析,將分離到的內(nèi)生真菌歸于10個(gè)屬,分別是鐮刀菌屬、根盤(pán)菌屬、炭疽菌屬、柱孢屬、翅孢殼屬、青霉屬、小不整球殼屬、曲霉屬、鏈格孢屬、帚枝霉屬等；另有編號(hào)8.16-10-2菌株為未培養(yǎng)真菌(uncultured fungus),其中鐮刀菌屬為三葉青塊根中的優(yōu)勢(shì)菌屬。此外,制作三葉青多年生塊根石蠟切片,采用番紅-固綠法染色并觀察,結(jié)果顯示,三葉青內(nèi)生真菌多散亂分布于細(xì)胞皮層及韌皮部部位,定殖于宿主植物塊根的單個(gè)或多個(gè)連續(xù)的細(xì)胞中。(3)選取三葉青塊根中出現(xiàn)頻率較高菌屬真菌的發(fā)酵液添加到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)三葉青無(wú)菌苗,熒光定量PCR檢測(cè)顯示,Th-9.7-1、Th-9.7-2、Th-11.23-1植株葉片中Th-exp基因均上調(diào)表達(dá),其中,Th-9.7-2中表達(dá)量約是對(duì)照組的3倍多,差異性最大；而Th-8.16-8、Th-8.16-13-1中Th-exp基因的表達(dá)量降低；植株Th-9.7-5中該基因表達(dá)量無(wú)明顯變化。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定葉片中藥用成分總黃酮的含量,結(jié)果顯示,9.7-1、9.7-5、8.16-8、11.23-1菌株均可誘導(dǎo)三葉青黃酮含量的升高,其中Th-9.7-5植株含量高達(dá)39.6194 mg/g·DW,而Th-9.7-2、Th-8.16-13-]中黃酮含量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
【關(guān)鍵詞】：三葉青 擴(kuò)展蛋白 內(nèi)生真菌 塊根 黃酮
【學(xué)位授予單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S567.239;Q93
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1 三葉青研究進(jìn)展13-16
• 1.1 三葉青的人工繁殖13-14
• 1.2 三葉青的化學(xué)成分14
• 1.3 三葉青的藥理作用14-16
• 2 擴(kuò)展蛋白基因研究進(jìn)展16-18
• 2.1 擴(kuò)展蛋白基因家族及蛋白結(jié)構(gòu)16-17
• 2.2 擴(kuò)展蛋白與植物的抗逆性17-18
• 3 內(nèi)生真菌研究進(jìn)展18-22
• 3.1 內(nèi)生真菌的物種普遍性與多樣性18-19
• 3.2 內(nèi)生真菌的生物學(xué)功能19-22
• 4 本研究的目的意義22-23
• 第二章 三葉青擴(kuò)展蛋白基因的克隆和表達(dá)分析23-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法23-32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 1.2 擴(kuò)展蛋白基因中間序列的克隆24-28
• 1.3 擴(kuò)展蛋白基因5'端序列的克隆28-30
• 1.4 擴(kuò)展蛋白基因3'端序列的克隆30
• 1.5 擴(kuò)展蛋白基因全長(zhǎng)cDNA的獲得30-31
• 1.6 擴(kuò)展蛋白基因的生物信息學(xué)分析31
• 1.7 擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)分析31-32
• 2 結(jié)果與分析32-39
• 2.1 擴(kuò)展蛋白中間序列分析32-33
• 2.2 擴(kuò)展蛋白5'端序列分析33-34
• 2.3 擴(kuò)展蛋白3'端序列分析34-35
• 2.4 Th-exp基因全序列的獲得及生物信息學(xué)分析35-38
• 2.5 Th-exp基因的表達(dá)分析38-39
• 3 討論39-41
• 第三章 三葉青塊根內(nèi)生真菌分離鑒定及細(xì)胞學(xué)觀察41-53
• 1 實(shí)驗(yàn)材料和方法41-45
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料41
• 1.2 塊根內(nèi)生真菌的分離純化41-42
• 1.3 塊根內(nèi)生真菌的鑒定42-43
• 1.4 塊根內(nèi)生真菌的進(jìn)化分析43
• 1.5 塊根內(nèi)生真菌的細(xì)胞學(xué)觀察43-45
• 2 結(jié)果與分析45-51
• 2.1 塊根內(nèi)生真菌的分離45-47
• 2.2 塊根內(nèi)生真菌的鑒定及進(jìn)化分析47-51
• 2.3 菌根石蠟切片觀察51
• 3 討論51-53
• 第四章 三葉青內(nèi)生真菌對(duì)擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)及黃酮含量的影響53-61
• 1 實(shí)驗(yàn)材料和方法53-55
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料53-54
• 1.2 三葉青無(wú)菌苗的獲得54
• 1.3 三葉青無(wú)菌苗接種內(nèi)生真菌54
• 1.4 不同處理三葉青中Th-exp基因表達(dá)的測(cè)定54
• 1.5 不同處理三葉青中總黃酮含量的測(cè)定54-55
• 2 結(jié)果與分析55-59
• 2.1 三葉青無(wú)菌苗的獲得55-56
• 2.2 三葉青的生長(zhǎng)情況56-57
• 2.3 不同處理三葉青中Th-exp基因表達(dá)分析57
• 2.4 不同處理三葉青中總黃酮含量的分析57-59
• 3 討論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 附錄69-76
• 研究生期間的科研成果76

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