發(fā)布時間：2017-10-11 02:27

  本文關鍵詞：Ⅱ類啟動子調控CRISPR系統(tǒng)中sgRNA的表達實現特異性的基因突變

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【摘要】：CRISPR/Cas9系統(tǒng),作為新興的強有力的基因編輯以及遺傳篩選工具,通過體外基因編輯,在疾病模型的建立以及基因治療等生物醫(yī)學領域方面具有廣泛的的應用前景。然而,CRISPR/Cas9系統(tǒng)在實際應用過程中仍然面臨著一些技術難題,問題之一就在于很難進行精準可控的基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在行使基因編輯功能的過程中主要包括兩個成員,Cas9蛋白和單鏈的引導RNA(sigle-guide RNA,sgRNA)。其中Cas9蛋白是由RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ)類啟動子調控表達的一種核酸酶,可以進行組織細胞的特異性表達調控。sgRNA用于識別靶位點,其轉錄是受到RNA聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ)類啟動子調控的。而Ⅲ類啟動子調控表達的一大缺陷就在于難以控制,受其調控的基因一般會呈現出類似于看家基因的“無處不在”表達的特點,因此使sgRNA也能以一種組織特異性表達調控的方式進行表達更有利于組織特異性基因突變的產生。本文中,我們對經典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行巧妙的修改,使sgRNA也能在RNA聚合酶Ⅱ類啟動子的調控下進行表達,并進一步通過使用細胞特異性啟動子來調控sgRNA的表達從而實現了細胞特異性的基因突變。為了能獲得RNA聚合酶Ⅱ類啟動子調控的sgRNA,我們構建獲得microRNA-shRNA與sgRNA鑲嵌(mi Rsh-sgRNA)盒。該結構中的sgRNA是受RNA聚合酶Ⅱ類啟動子調控的,并能夠從紅色熒光蛋白的3,非翻譯區(qū)(untranslational region,UTR)轉錄出來,為了檢測功能性的sgRNA能否在此結構中順利產生,我們將廣譜性啟動子EF1a調控的miRsh-sgp53表達載體以及Cas9-P2A-EGFP表達載體共同轉染小鼠成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)。轉然后兩基因一般會呈現出類似于看家基因的“無處不在”表達的特點,因此使sgRNA也能以一種組織天采用流式細胞分選(flurorescence-activated cell sorting,FACS)的方式分選出雙熒光蛋白表達的細胞,并對分選出的細胞進一步進行T7EN1酶切及sanger測序,結果表明無論是MEFs還是mESCs,EF1a啟動子調控mi Rsh-sgp53產生的sg RNA都能夠引導Cas9蛋白對p53基因進行雙鏈切割(double strand breaks,DSB)。為了進一步證實是否mi Rsh-sg RNA盒能夠以細胞類型特異性的方式產生基因突變,我們構建獲得小鼠胚胎類啟動子調控的。而Ⅲ類啟動子調控表達的一大缺陷就在于難以控制,受其調控的基因一般會呈現出類干細胞特異性的Oct4啟動子(mouse Oct4 gene promoter,mOct4P)來調控sgRNA表達的mi Rsh-sgp53盒,將該載體以及EF1a啟動子調控表達的Cas9-P2A-EGFP表達載體共同轉染MEFs和mESCs兩天后,在mESCs中,我們能夠觀察到紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白共同表達的細胞,但在MEFs中,僅有綠色熒光蛋白的表達,這一現象表明sgRNA以細胞類型特異性的方式產生。通過流式細胞分選的方式分選出這兩類細胞進一步進行T7EN1酶切及sanger測序分析。我們發(fā)現p53基因的突變僅發(fā)生在小鼠胚胎干細胞中,而沒有發(fā)生在小鼠成纖維細胞中。此外,T7EN1酶切及sanger測序表明我們構建的這種由RNA聚合酶Ⅱ類啟動子調控CRISPR/Cas9系統(tǒng)較經典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在所有被檢測的細胞中,均沒有帶來額外的脫靶效應。
【關鍵詞】：CRISPR/Cas9系統(tǒng) 單鏈引導RNA RNA聚合酶Ⅱ類啟
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-24
• 1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)12-18
• 1.1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現12
• 1.1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結構12-13
• 1.1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機理13-15
• 1.1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類15
• 1.1.5 CRISPR/Cas9基因編輯技術研究進展15-16
• 1.1.6 CRISPR/Cas9基因編輯技術的應用16-18
• 1.1.7 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的誘導性調控18
• 1.2 miRNA-shRNA嵌套結構18-21
• 1.2.1 RNA干擾技術18-20
• 1.2.2 miRNA-shRNA嵌套結構的出現20-21
• 1.3 P53基因概述21-22
• 1.4 本研究的目的及意義22-24
• 2 材料與方法24-45
• 2.1 實驗材料24-30
• 2.1.1 質粒24
• 2.1.2 工具酶、試劑盒及其它試劑24-26
• 2.1.3 引物序列26-27
• 2.1.4 主要器材27-28
• 2.1.5 緩沖液及主要試劑的配制28-30
• 2.1.6 主要生物學分析軟件30
• 2.2 實驗方法30-45
• 2.2.1 載體骨架的構建30-35
• 2.2.2 miRsh-sgp53的構建35-37
• 2.2.3 RNA聚合酶Ⅱ類啟動子調控的miRsh-sgp53載體的構建37-41
• 2.2.4 細胞培養(yǎng)及轉染41-43
• 2.2.5 流式細胞儀分選陽性細胞43
• 2.2.6 T7EN1酶切實驗43-44
• 2.2.7 sanger測序44-45
• 3 結果與分析45-51
• 3.1 RNA聚合聚合酶Ⅱ類啟動子調控的miRsh-sgp53載體的構建45-47
• 3.2 EF1a調控miRsh-sgp53盒內的sgRNA的表達情況47
• 3.3 干細胞特異性啟動子調控miRsh-sgRNA盒內的sgRNA的表達情況47-48
• 3.4 miRsh-sgRNA盒差生脫靶效應情況48-51
• 4 討論51-52
• 5 結論52-53
• 致謝53-54
• 參考文獻54-59
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文59

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本文編號：1009996