能源是人類社會生存和發(fā)展的基本條件,針對傳統(tǒng)化石能源面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn),尋求新的可再生的替代能源是當(dāng)今能源發(fā)展的趨勢,而氫作為優(yōu)良的能源載體得到了廣泛的關(guān)注。產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）是一種極具應(yīng)用前景的兼性厭氧產(chǎn)氫菌,它能廣泛地利用各種碳源生長,產(chǎn)氫速率較高,具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。本研究通過敲除NADH脫氫酶親水性亞基的基因（nuoCDE）,過表達(dá)小RNA RyhB和NAD合成酶三種方法增強(qiáng)產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫速率,并利用高壓液相色譜（HPLC）和高效氣相色譜分析突變株代謝流的再分配。本文運用CRISPR-Cas9基因編輯方法敲除產(chǎn)氣腸桿菌IAM1183中的nuoCDE基因,得到了一株雙敲除突變株IAM1183-CD（ΔnuoC/ΔnuoD）和一株三敲除突變株IAM1183-CDE（Δnuo C/Δnuo D/ΔnuoE）。100ml血清瓶厭氧發(fā)酵實驗結(jié)果顯示突變株IAM1183-CD,IAM1183-CDE的產(chǎn)氫量相較于原始菌分別增加了24.5%,45.6%。其中菌株IAM1183-CDE的NADH產(chǎn)氫途徑的產(chǎn)氫量顯著增加表明nuoE基因在調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH濃度的... 

【文章來源】：浙江理工大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 引言
    1 氫能源前景概述
        1.1 傳統(tǒng)化石能源面臨的問題
        1.2 生物煉制的重要性
        1.3 生物法制氫的生產(chǎn)方法
            1.3.1 熱轉(zhuǎn)化制氫
            1.3.2 生物轉(zhuǎn)化制氫
    2 發(fā)酵生物制氫的研究進(jìn)展
        2.1 發(fā)酵制氫菌株及其底物利用能力
        2.2 發(fā)酵制氫代謝途徑
            2.2.1 專性厭氧菌產(chǎn)氫途徑
            2.2.2 兼性厭氧菌產(chǎn)氫途徑
        2.3 微生物存在的氫酶
            2.3.1 發(fā)酵制氫過程所涉及的氫酶
            2.3.2 NADH氫酶與NADH脫氫酶的關(guān)系
    3 小RNA RyhB的結(jié)構(gòu)與功能
        3.1 小RNA RyhB的結(jié)構(gòu)
        3.2 小RNA RyhB的功能
    4 本論文的研究對象產(chǎn)氣腸桿菌
    5 本課題的研究意義和技術(shù)路線
        5.1 研究意義與立題思想
        5.2 研究技術(shù)路線
        5.3 研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    1 材料
        1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.2 引物
        1.3 基因操作實驗相關(guān)的酶以及試劑盒列表
        1.4 培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及常用試劑的配置
    2 實驗方法
        2.1 質(zhì)粒提取
        2.2 基因組DNA的小量提取
        2.3 瓊脂糖凝膠中DNA回收（PCR產(chǎn)物DNA回收）
        2.4 基因克隆
            2.4.1 引物儲存液與工作液的制備
            2.4.2 PCR反應(yīng)體系的配方
            2.4.3 PCR擴(kuò)增程序
            2.4.4 菌落PCR
        2.5 DNA片段的酶切與連接
        2.6 DNA片段overlap PCR連接
        2.7 多片段連接及其環(huán)化
        2.8 轉(zhuǎn)化
            2.8.1 大腸桿菌電激感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.8.2 大腸桿菌電激轉(zhuǎn)化
            2.8.3 大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.8.4 大腸桿菌CaCl2法轉(zhuǎn)化
        2.9 瓊脂糖凝膠電泳分析
        2.10 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
        2.11 RNA提取及Northern Bolt
            2.11.1 基因組RNA提取
            2.11.2 Northern轉(zhuǎn)膜
        2.12 發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定
        2.13 氫酶酶活的檢測方法
            2.13.1 LDH、ADH和BDDH酶活的測定
        2.14 基于CRISPER-CAS9基因整合技術(shù)
            2.14.1 CRISPER-CAS9基因整合技術(shù)操作步驟
第三章 敲除菌株及質(zhì)粒的構(gòu)建
    1 構(gòu)建基因工程菌株IAM1183-CD和IAM1183-CDE
        1.1 引言
        1.2 敲除菌株和引物
        1.3 敲除結(jié)果
            1.3.1 IAM1183-CD敲除結(jié)果
    2 構(gòu)建外源表達(dá)小RNA RyhB表達(dá)載體
        2.1 引言
        2.2 菌株和質(zhì)粒
            2.2.1 攜帶有氯霉素抗性RyhB表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3 Northern Bolt驗證
    3 構(gòu)建外源表達(dá)Nad合成酶表達(dá)載體
        3.1 引言
        3.2 Nad合成酶表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3 SDS-PAGE驗證
    4 小結(jié)與討論
第四章 基因工程菌株功能檢測及發(fā)酵產(chǎn)氫結(jié)果
    1 各菌株生長曲線和pH
    2 各菌株血清瓶批式發(fā)酵產(chǎn)氫量及代謝產(chǎn)物含量
        2.1 測定發(fā)酵液中有機(jī)酸和醇類的含量
        2.2 發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定
        2.3 結(jié)果與分析
    3 各菌株產(chǎn)氫代謝途徑和氫酶酶活分析
        3.1 各菌株甲酸途徑與NADH產(chǎn)氫途徑分析
        3.2 各菌株NADH依賴型氫酶酶活分析
    4 發(fā)酵罐發(fā)酵制氫
    5 小結(jié)與討論
第五章 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]新常態(tài)下中國能源供給側(cè)改革的路徑探析——基于產(chǎn)能、結(jié)構(gòu)和消費模式的視角[J]. 岳立,楊帆.  經(jīng)濟(jì)問題. 2016(10)
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[5]“氫經(jīng)濟(jì)”與氫能發(fā)展戰(zhàn)略的思考[J]. 王革華,戴志遠(yuǎn).  太陽能. 2005(03)



本文編號：3077070