【摘要】：氫能被認(rèn)為是未來(lái)最理想的能源之一。生物制氫因具有可持續(xù)、條件溫和、環(huán)境友好,且可與污染物處理相偶聯(lián)等優(yōu)點(diǎn),而越來(lái)越受到人們的重視。然而,截至目前生物制氫的研究尚未取得突破性進(jìn)展,工程菌的產(chǎn)氫效率遠(yuǎn)未達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的要求。因此,闡明生物產(chǎn)氫機(jī)理、提高產(chǎn)氫效率仍是生物制氫亟待解決的重要科學(xué)問(wèn)題。本研究以一株野生型產(chǎn)氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes) CCTCC AB91102為出發(fā)菌株,該菌為兼性厭氧菌,且分子生物學(xué)操作便利,生長(zhǎng)速率高,在理想條件下具有最高的理論產(chǎn)氫效率(10mol H2/mol葡萄糖),產(chǎn)氫能力提升空間大。為提高E.aerogenes的產(chǎn)氫能力,并明晰其產(chǎn)氫機(jī)理,分別或同時(shí)敲除了吸氫酶基因和產(chǎn)氫競(jìng)爭(zhēng)途徑中關(guān)鍵酶基因,在此基礎(chǔ)上,通過(guò)過(guò)表達(dá)NAD合成酶,研究了細(xì)胞中NAD水平對(duì)產(chǎn)氫代謝中碳流分配的影響。同時(shí),為使得到的高效產(chǎn)氫工程菌能夠運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中,還對(duì)可再生廢棄物的預(yù)處理方法進(jìn)行了探索,以微藻水解產(chǎn)物為底物,高效工程菌為生產(chǎn)菌株,進(jìn)行了厭氧批次產(chǎn)氫發(fā)酵實(shí)驗(yàn),優(yōu)化了發(fā)酵參數(shù)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果摘要如下。1.敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑關(guān)鍵酶基因ldh和ppc對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫的影響。乳酸和琥珀酸是E.aerogenes CCTCC AB91102除產(chǎn)氫外最主要的糖酵解產(chǎn)物。本研究從該菌基因組DNA中克隆得到編碼產(chǎn)乳酸途徑關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶(LDH)的基因ldh和產(chǎn)琥珀酸途徑關(guān)鍵酶編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因ppc。利用這兩個(gè)基因的PCR產(chǎn)物在Red重組系統(tǒng)的介導(dǎo)下與基因組中的基因進(jìn)行同源重組。經(jīng)PCR驗(yàn)證、抗性驗(yàn)證和代謝產(chǎn)物分析,表明目標(biāo)基因已從基因組中完全敲除。所得到的三個(gè)突變菌株中AB91102-L (△ldh)和AB91102-P (△ppc)產(chǎn)氫效率相對(duì)野生菌分別提高了12.4%和32.2%,產(chǎn)氫量分別降低4.5%和6.1%,AB91102-L產(chǎn)乳酸途徑被阻斷,AB91102-P產(chǎn)琥珀酸降低94.6%。雙基因敲除菌株AB91102-LP(△ldh, △ppc)生長(zhǎng)緩慢,產(chǎn)氫量顯著降低。2.敲除吸氫途徑關(guān)鍵酶小亞基基因hybO對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫的影響。從E.aerogenes基因組中克隆得到hybO基因后,其PCR產(chǎn)物通過(guò)Red重組系統(tǒng)介導(dǎo)與野生菌、AB91102-L和AB91102-P分別進(jìn)行同源重組得到三個(gè)突變菌株AB91102-O(△HybO)、AB91102-OL (△hybO/Aldh)和AB91102-OP (△hybO/△ppc),其中突變菌株AB91102-O和AB91102-OP的產(chǎn)氫效率相對(duì)野生菌分別提高24.0%和68.8%,產(chǎn)氫量相對(duì)野生菌分別增加21.3%和27.6%。AB91102-OP產(chǎn)氫能力的顯著增長(zhǎng)表明,減少氫氣消耗和阻斷競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑是提高產(chǎn)氫的有效策略,同時(shí)存在某種程度的協(xié)同效應(yīng)。3.過(guò)表達(dá)NAD合成酶促進(jìn)產(chǎn)氣腸桿菌及其突變菌產(chǎn)氫的研究。從AB91102基因組中克隆得到編碼NAD合成酶的基因nadE。通過(guò)對(duì)pET-28(+)質(zhì)粒進(jìn)行改造,獲得能夠在E. aerogenes中表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒pET28kan。構(gòu)建pET28kan-nadE,轉(zhuǎn)入AB91102野性型和多株突變體中,SDS-PAGE和Western-Blot實(shí)驗(yàn)證明NAD合成酶內(nèi)源表達(dá)成功,獲得兩個(gè)突變菌株AB91102-O/N(△HybO/nadE)、 AB91102-OP/N(AhybO/△ppc/nadE)和一個(gè)對(duì)照菌株AB91102-OC。厭氧恒化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AB91102-ON和AB91102-OP/N的NADH/NAD+總濃度較對(duì)照菌分別增加了91.2%和109.7%,但NADH/NAD+比值則分別從1.11下降到0.83和0.94.AB91102-ON的產(chǎn)氫效率和產(chǎn)氫量分別增長(zhǎng)了66.0%和165.8%, AB91102-OP/N則分別增長(zhǎng)了149.5%和301.1%,AB91102-OP/N的最高產(chǎn)氫量達(dá)到了5.1L/L。通過(guò)分析代謝終產(chǎn)物濃度、產(chǎn)氫直接相關(guān)的NADH利用率(NADH)uH/Glu(該概念為本文首次提出)以及ADH、LDH和BDDH等酶活的變化,結(jié)果表明：降低氫氣消耗、提高NADH的利用率和提高NAD的總濃度三種策略對(duì)促進(jìn)產(chǎn)氫的協(xié)同效應(yīng)明顯。4.預(yù)處理“微藻提脂殘留物”(LMBRs)的方法研究。利用“脂肪酶發(fā)酵酵母殘余物”(LYBRs)自溶產(chǎn)物中存在的蛋白酶,在48℃下催化處理LMBRs 24 h,使LMBRs中總氮含量降低了45.0%。將處理和未處理過(guò)的樣品進(jìn)行熱堿法水解,得出在100℃下處理過(guò)的LMBRs產(chǎn)還原糖和可溶性總氮的量均最高,分別為189.3 mg/gLBMRs和36.56 mg/g LBMRs,其中氨基酸含量為102.8 mg/g LBMRs;未用自溶產(chǎn)物處理過(guò)的LMBRs水解產(chǎn)生的還原糖僅為該產(chǎn)量的87.1%。說(shuō)明以酵母自溶物預(yù)處理再進(jìn)行熱堿水解是一種簡(jiǎn)單有效的LMBRs處理方法。5.優(yōu)化以LMBRs水解產(chǎn)物為底物產(chǎn)氫發(fā)酵條件。采用中心組合設(shè)計(jì),通過(guò)三次平行實(shí)驗(yàn)取得的數(shù)值,擬合得到反應(yīng)溫度、接種量和pH值與產(chǎn)氫量之間關(guān)系的多元二次回歸模型。方差分析(ANOVA)結(jié)果顯示,該模型的顯著性和可靠性較高,擬合效果良好。該模型預(yù)測(cè)出的最佳產(chǎn)氫結(jié)果為54.22 mL/g LMBRs,產(chǎn)氫條件為溫度37.55℃,接種量12.25%,pH值5.95。進(jìn)行了厭氧批次發(fā)酵產(chǎn)氫驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)際結(jié)果為54.61 mL/g LMBRs,與預(yù)測(cè)值十分接近,說(shuō)明該模型能較好反映三因素對(duì)產(chǎn)氫量的影響。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q939.97;TQ116.2
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本文編號(hào)：2468742