本文關鍵詞：β-N-乙酰己糖胺酶的異源表達及酶學性質研究

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【摘要】：幾丁質是由N-乙酰-D-胺基葡萄糖(GlcNAc)單體通過β-1,4鍵組成的多糖,主要來源于昆蟲與甲殼類動物,每年約有100億噸的生物合成量,是地球上第二豐富的生物質。隨著中國經濟水平的發(fā)展,人民生活水平不斷提高,蟹、蝦等海產或水產甲殼類動物的消費量越來越大,但其殼卻常被直接丟棄,導致幾丁質未獲得有效利用;且因幾丁質在自然界中分解緩慢,還造成環(huán)境污染。幾丁質可被內切幾丁質酶水解生成殼寡糖,β-N-乙酰己糖胺酶可進一步水解殼寡糖生成GlcNAc。Glc NAc可應用于制藥、功能性食品及化妝品等領域。目前,幾丁質酶的商業(yè)化還面臨很多的問題,其中一個重要的問題是β-N-乙酰己糖胺酶的活力低。此外,耐鹽酶可應用于海產品加工等領域,在高鹽環(huán)境下加工食品還可以防止微生物的污染、節(jié)省滅菌等所消耗的能源,但耐鹽的β-N-乙酰己糖胺酶還尚未報導。本論文以解決幾丁質的有效利用為目的,對3種β-N-乙酰己糖胺酶進行了異源表達和酶學性質研究。(1)本研究從3種細菌Sphingobacterium sp.HWLB1、Shinella sp.JB10和Microbacterium sp.HJ5中分別獲得了重組β-N-乙酰己糖胺酶rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag,與已經報導酶學性質的β-N-乙酰己糖胺酶最高一致性分別為31%,41%和30%。(2)rHL1nag、rJB10nag及rHJ5nag的最適pH分別為pH 7.0、pH 6.0和pH 6.0,最適溫度分別為40℃、50℃和45℃。(3)在最適條件下,rHJ5nag對2 mmol/L p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide和p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-galactosaminide、及0.50%(w/v)N,N'-diacetyl chitobiose和N,N',N'',N'''-tetraacetyl chitotetraose的比活分別為1773.08±1.06 U mg-1、145.97±3.13 U mg-1、481.43 U mg-1和445.05 U mg-1,該酶對2 mmol/L p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide的Km、Vmax和kcat分別為0.70 mmol L-1、4046.00 mol min-1 mg-1和4344.00 s-1。(4)NaCl抗性:在20%(w/v)的NaCl中,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag的酶活分別為127%、56%和54%。NaCl穩(wěn)定性:經10%(w/v)NaCl處理1 h,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag的酶活分別剩余127%、75%和119%。(5)在25℃及pH 6.0條件下,rHL1nag、rJB10nag和rHJ5nag與商業(yè)內切幾丁質酶協(xié)同作用幾丁質降解,協(xié)同度分別為3.57、2.35和2.02。本研究獲得了具有高活力和高耐鹽性的β-N-乙酰己糖胺酶,其協(xié)同參與幾丁質的有效降解,在幾丁質的酶法加工及利用中具有潛在的應用價值,也為β-N-乙酰己糖胺酶相關活性機理的研究提供了良好的素材。
【關鍵詞】：幾丁質 β-N-乙酰己糖胺酶 比活 耐鹽性
【學位授予單位】：云南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 術語及符號說明10-11
• 第1章 緒論11-24
• 1.1 幾丁質及其降解產物的應用11-12
• 1.2 β-N-乙酰己糖胺酶研究概況12-20
• 1.2.1 幾丁質酶與 β-N-乙酰己糖胺酶12-14
• 1.2.2 β-N-乙酰己糖胺酶的分類14
• 1.2.3 β-N-乙酰己糖胺酶的來源與性質14-16
• 1.2.4 β-N-乙酰己糖胺酶的結構16-17
• 1.2.5 β-N-乙酰己糖胺酶的酶學性質17-19
• 1.2.6 β-N-乙酰己糖胺酶的功能19-20
• 1.3 β-N-乙酰己糖胺酶的應用20-22
• 1.3.1 β-N-乙酰己糖胺酶在幾丁質降解中的應用20
• 1.3.2 β-N-乙酰己糖胺酶在綠色農藥中的應用20-21
• 1.3.3 β-N-乙酰己糖胺酶在醫(yī)學上的應用21
• 1.3.4 β-N-乙酰己糖胺酶在水生生態(tài)毒理學中的應用21-22
• 1.4 研究目的和意義22-23
• 1.5 研究內容23-24
• 第2章 重組 β-N-乙酰己糖胺酶基因的異源表達及純化24-46
• 2.1 實驗材料24-27
• 2.1.1 菌株和質粒24
• 2.1.2 主要儀器24-25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 常用溶液25-26
• 2.1.5 常用培養(yǎng)基26-27
• 2.1.6 DNA測序與引物合成27
• 2.2 實驗方法27-33
• 2.2.1 序列分析27
• 2.2.2 原核表達載體的構建27-29
• 2.2.3 重組質粒的轉化29-30
• 2.2.4 重組 β-N-乙酰己糖胺酶在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中的誘導表達30
• 2.2.5 重組 β-N-乙酰己糖胺酶的純化和鑒定30-33
• 2.3 實驗結果與分析33-43
• 2.3.1 重組 β-N-乙酰己糖胺酶的基因表達33-34
• 2.3.2 重組 β-N-乙酰己糖胺酶的純化和鑒定34-37
• 2.3.3 重組 β-N-乙酰己糖胺酶的序列分析37-43
• 2.4 討論43-44
• 2.5 本章小結44-46
• 第3章 重組 β-N-乙酰己糖胺酶的酶學性質46-82
• 3.1 實驗材料46-47
• 3.1.1 主要試劑46
• 3.1.2 常用溶液46-47
• 3.2 實驗方法47-57
• 3.2.1 重組 β-N-乙酰己糖胺酶的定量47
• 3.2.2 重組 β-N-乙酰己糖胺酶的酶活測定方法47-49
• 3.2.3 重組 β-N-乙酰己糖胺酶的酶學特性分析49-57
• 3.3 實驗結果與分析57-79
• 3.3.1 重組 β-N-乙酰己糖胺酶r HL1nag的酶學性質研究57-65
• 3.3.2 重組 β-N-乙酰己糖胺酶r JB10nag的酶學性質研究65-72
• 3.3.3 重組 β-N-乙酰己糖胺酶r HJ5nag的酶學性質研究72-79
• 3.4 討論79-81
• 3.5 本章小結81-82
• 第4章 總結與展望82-86
• 4.1 總結82-85
• 4.2 創(chuàng)新85
• 4.3 展望85-86
• 致謝86-87
• 參考文獻87-96
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文和研究成果96-97
• 附錄97-105
• 附錄A 實驗中所使用的緩沖液的配置97-99
• A1 不同pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的配制97-98
• A2 不同pH值的甘氨酸-NaOH緩沖液的配制98
• A3 不同pH值的Tris-HCl緩沖液的配制98-99
• 附錄B 三個重組 β-N-乙酰己糖胺酶基因序列99-103
• B1 HL1nag的核酸序列99-100
• B2 JB10nag的核酸序列100-101
• B3 HJ5nag的核酸序列101-103
• 附錄C 三個重組 β-N-乙酰己糖胺酶氨基酸序列103-105
• C1 HL1nag的氨基酸序列103
• C2 JB10nag的氨基酸序列103-104
• C3 HJ5nag的氨基酸序列104-105
• 附錄D 氨基酸中英文對照及縮寫表105

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本文編號：899173