本文關鍵詞：基于鏈替代信號放大技術靈敏檢測疾病相關靶分子的研究

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【摘要】：核酸和蛋白質是組成生物體的兩種重要大分子物質,在生物體的生命活動中發(fā)揮至關重要的作用。因此對于這兩類生物大分子的分析檢測已經發(fā)展成為當代生物分析化學的研究熱點。追求簡單、靈敏、穩(wěn)定、特異性好的分析檢測方法是當前研究的重點。目前基于核酸探針的信號放大技術大都是利用各種工具酶和納米材料進行信號放大實現(xiàn)分析物的靈敏測定,但是在此過程中往往需要引入其他的輔助酶,費用較高,同時需要嚴格控制酶的存儲以及操作條件。另外對于復雜體系中樣品測定,有較強的背景干擾,不利于測定。因此,如何建立新的抗干擾的生物信號放大檢測技術平臺以及新的信號轉換方式,來更好的解決生物分子分析過程中存在的上述問題,仍是研究的熱點以及難點。本工作,基于無需酶輔助的鏈替代信號放大技術,結合新的信號轉換方式和微磁球的表面固定化,構建了一系列新方法用于蛋白質以及核酸的靈敏測定。主要研究內容和結果可歸納為以下兩個方面：一、基于雙重信號放大技術檢測T4多聚核苷酸激酶活性及抑制熒光法的研究基于鏈替代和環(huán)糊精增敏作用的雙重信號放大技術,以對距離敏感的芘分子作為信號轉換元件,建立了一種均相、靈敏、快速檢測T4多聚核苷酸激酶(PNK)活性以及抑制的熒光法。以非標記的發(fā)卡探針H1作為PNK的底物,單標記的發(fā)卡探針H2、H3作為信號探針。在RNK、lambda核酸外切酶(λexo)存在時,以磷酸化誘導的λexo切割作用所釋放的DNA作為鏈替代反應的引發(fā)鏈,打開發(fā)卡探針H2。打開的探針H2接著打開探針H3,形成H2/H3雜交雙鏈的同時重新釋放出引發(fā)鏈,使得芘分子單體相互靠近,形成芘分子二聚體,體系熒光信號增強,實現(xiàn)第一步信號放大。隨后加入γ-環(huán)糊精(γ-CD),由于γ-CD可以保護芘分子二聚體的熒光不受周圍環(huán)境干擾,同時可進一步拉近二聚體分子間的距離,使得芘分子二聚體的熒光信號進一步增強,實現(xiàn)第二步信號放大�；谏鲜鲭p重信號放大技術,PNK活性檢測的線性范圍為0.0005-5 U/mL,檢出限9.3×10-5U/mL。不同抑制劑對于PNK活性影響的研究表明該方法還可以用于抑制劑篩選。因此,該方法是一種簡單、靈敏、快速的PNK活性檢測以及酶抑制劑研究的熒光法。二、基于鏈替代循環(huán)放大法靈敏檢測端粒酶RNA流式法的研究基于磁性微球(MB)的可控磁分離和鏈替代反應信號放大作用,建立了-種簡單、靈敏、抗干擾的檢測端粒酶RNA(hTR)的流式新方法。首先,將生物素化的發(fā)卡探針H1固定到鏈霉親和素化的磁性微球(MB)表面,通過磁分離除掉多余H1。當目標物不存在時,發(fā)夾探針H1與H2在溶液中保持自身的發(fā)夾結構,鏈替代反應無法發(fā)生,熒光標記的H2探針不能富集到磁性微球(MB)表面。當目標hTR存在時,hTR能夠打開探針H1,打開的探針H1可以與一端標記羧基熒光素的探針H2發(fā)生鏈替代反應,在磁珠表面形成H1/H2的雜交雙鏈。替代下來的hTR循環(huán)引發(fā)鏈替代反應,使得熒光信號在磁性微球表面富集。通過該鏈替代信號放大作用,目標物的檢測線性范圍為0.001 nM到1 nM,檢出限為0.0003nM。同時該方法還能區(qū)分單堿基突變。因此該方法是一種簡單、快速、穩(wěn)定檢測端粒酶RNA的流式法。
【關鍵詞】：磷酸化 熒光 流式法 端粒酶RNA(hTR) 鏈替代信號放大
【學位授予單位】：陜西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 緒論10-34
• 1.1 核酸和蛋白質檢測的意義10
• 1.2 基于核酸探針的核酸和蛋白質的檢測10-17
• 1.2.1 基于核酸探針的電化學檢測途徑11-12
• 1.2.2 基于核酸探針的比色檢測途徑12-13
• 1.2.3 基于核酸探針的表面增強拉曼散射檢測途徑13-15
• 1.2.4 基于核酸探針的熒光檢測途徑15-16
• 1.2.5 基于核酸探針的流式檢測途徑16-17
• 1.3 核酸探針信號放大技術及其在生物分析檢測中的應用17-31
• 1.3.1 工具酶輔助的信號放大18-24
• 1.3.2 基于DNA自組裝的信號放大24-27
• 1.3.3 基于納米材料的信號放大的信號放大27-30
• 1.3.4 基于微磁球的信號放大30-31
• 1.4 選題依據及研究內容31-34
• 第2章 基于雙重信號放大技術檢測T4多聚核苷酸激酶活性及抑制熒光法的研究34-50
• 2.1 引言34-35
• 2.2 實驗部分35-37
• 2.2.1 試劑和儀器35-36
• 2.2.2 實驗步驟36-37
• 2.3 實驗結果與討論37-48
• 2.3.1 實驗原理及驗證37-42
• 2.3.2 條件優(yōu)化42-44
• 2.3.3 選擇性考察44-45
• 2.3.4 靈敏度考察45-46
• 2.3.5 抑制劑考察46-48
• 2.4 小結48-50
• 第3章 基于鏈替代循環(huán)放大檢測端粒酶RNA流式法的研究50-64
• 3.1 引言50-51
• 3.2 實驗部分51-53
• 3.2.1 試劑與儀器51-52
• 3.2.2 實驗步驟52-53
• 3.3 實驗結果與討論53-62
• 3.3.1 實驗原理及驗證53-57
• 3.3.2 條件優(yōu)化57-58
• 3.3.3 方法靈敏度考察58-60
• 3.3.4 選擇性考察60-61
• 3.3.5 復雜體系中端粒酶RNA測定61-62
• 3.4 小結62-64
• 結論64-66
• 參考文獻66-78
• 致謝78-80
• 攻讀學位期間研究成果80

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本文編號：613098