蛋白質(zhì)作為細胞生物功能的執(zhí)行者主要取決于它們的三維結(jié)構(gòu),其中既包括天然折疊的結(jié)構(gòu)蛋白,也有缺乏穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的固有無序蛋白。不同的蛋白可以實現(xiàn)細胞不同的生理過程,蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析有助于闡明蛋白質(zhì)行使功能的分子機制。因此,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域中的一個重要部分。蛋白質(zhì)與配體的相互作用是細胞實現(xiàn)特定功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)-配體相互作用作為細胞內(nèi)一種極其重要的生物分子活動參與細胞周期的各個生物學(xué)過程,諸如信號傳導(dǎo)、能量代謝、基因調(diào)控、酶催化、免疫反應(yīng)等過程均伴隨著相關(guān)蛋白質(zhì)與底物、配體或小分子的結(jié)合。蛋白質(zhì)-配體相互作用及其組成的作用網(wǎng)絡(luò)的研究不僅有助于我們認識生命活動的分子機制,同時對臨床疾病的診斷和治療也具有重要意義。核磁共振波譜作為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和與其它生物分子相互作用的重要方法,特別是對溶液中蛋白質(zhì)的研究獨具優(yōu)勢。本論文選取了三個蛋白一人源蛋白GAS7-SH3,羊駝納米抗體Nb26(兩者均為天然折疊蛋白)和人源蛋白TGIF1-RD2(預(yù)測為內(nèi)源性無序蛋白)作為研究對象,基于核磁共振波譜方法并結(jié)合其它生物物理和生物化學(xué)方法對它們的結(jié)構(gòu)與功能展開研究,具體的研究結(jié)果如下:1.人源蛋白...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第1章 引言
    1.1 研究對象概述
        1.1.1 生長阻滯特異性蛋白GAS7研究概述
        1.1.2. 轉(zhuǎn)化生長作用因子TGIF1的研究概述
        1.1.3 納米抗體研究概述
    1.2 核磁共振研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)
        1.2.1 核磁共振技術(shù)的基本原理及特征
        1.2.2 核磁共振解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本參數(shù)
            1.2.2.1 化學(xué)位移
            1.2.2.2 自旋耦合
            1.2.2.3 核奧弗豪塞效應(yīng)
        1.2.3 核磁共振解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一般流程
            1.2.3.1 同位素標記蛋白樣品的制備
            1.2.3.2 實驗數(shù)據(jù)的采集與處理
            1.2.3.3 蛋白質(zhì)原子的化學(xué)位移歸屬
            1.2.3.4 結(jié)構(gòu)計算約束條件的獲取
            1.2.3.5 結(jié)構(gòu)計算與優(yōu)化
    1.3 蛋白質(zhì)與配體相互作用的研究方法
        1.3.1 核磁滴定
        1.3.2 噬菌體展示技術(shù)
        1.3.3 酵母雙雜交技術(shù)
        1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法
    1.4 課題研究的出發(fā)點
第2章 GAS7-SH3的結(jié)構(gòu)解析與特異性多肽配體的篩選
    2.1 引言
    2.2 實驗材料和方法
        2.2.1 材料與儀器
            2.2.1.1 實驗試劑
            2.2.1.2 實驗儀器
        2.2.2 GAS7-SH3重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2.1 目的基因的擴增
            2.2.2.2 目的基因的回收以及載體的酶切、酶連
            2.2.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、提取與鑒定
        2.2.3 GAS7-SH3的表達與純化
            2.2.3.1 GAS7-SH3的表達
            2.2.3.2 ¹⁵N標記和¹³C,¹⁵N標記的蛋白表達
            2.2.3.3 GAS7-SH3的純化
            2.2.3.4 多肽儲液的配制
        2.2.4 GAS7-SH3的樣品表征
            2.2.4.1 質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量
            2.2.4.2 靜態(tài)光散射實驗
        2.2.5 GAS7-SH3的結(jié)構(gòu)解析
            2.2.5.1 GAS7-SH3核磁數(shù)據(jù)采集與處理
            2.2.5.2 GAS7-SH3化學(xué)位移歸屬與結(jié)構(gòu)計算
        2.2.6 GAS7-SH3蛋白特異性多肽配體的篩選
            2.2.6.1 噬菌體肽文庫的擴增
            2.2.6.2 噬菌體肽文庫的淘選
            2.2.6.3 噬菌體滴度的測定
            2.2.6.4 陽性噬菌體克隆的鑒定與序列測定
        2.2.7 多肽配體與GAS7-SH3蛋白的核磁滴定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 GAS7-SH3的樣品制備
        2.3.2 GAS7-SH3的液體核磁結(jié)構(gòu)
        2.3.3 GAS7-SH3蛋白的功能預(yù)測
            2.3.3.1 基于蛋白質(zhì)序列相似性的功能預(yù)測
            2.3.3.2 基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的功能預(yù)測
        2.3.4 P41與GAS7-SH3蛋白的核磁滴定
        2.3.5 GAS7-SH3蛋白特異性多肽配體的篩選
    2.4 小結(jié)
第3章 TGIF1-RD2的同源寡聚及其識別輔阻遏蛋白SIN3A-PAH的分子機制研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與方法
        3.2.1 材料與儀器
        3.2.2 TGIF1-RD2(256-375,256-401)及SIN3A-PAH2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 TGIF1-RD2(256-401)突變體的構(gòu)建
        3.2.4 TGIF1-RD2(256-375,256-401)及SIN3A-PAH2的表達與純化
            3.2.4.1 TGIF1-RD2(256-375)的表達與純化
            3.2.4.2 TGIF1-RD2(256-401)的表達與純化
            3.2.4.3 SIN3A-PAH2的表達與純化
        3.2.5 樣品表征
        3.2.6 圓二色譜實驗
        3.2.7 TGIF1-RD2(256-401)的主鏈化學(xué)位移歸屬
        3.2.8 酵母雙雜交實驗
        3.2.9 TGIF1-RD2(256-375,256-401)與SIN3A-PAH2的核磁滴定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 TGIF1-RD2(256-375,256-401)和SIN3A-PAH2的樣品制備
            3.3.1.1 TGIF1-RD2(256-375)的樣品制備
            3.3.1.2 TGIF1-RD2(256-401)的樣品制備
            3.3.1.3 SIN3A-PAH2的樣品制備
        3.3.2 TGIF1-RD2(256-401)的結(jié)構(gòu)特征
        3.3.3 TGIF1-RD2(256-401)的同源寡聚
            3.3.3.1 TGIF1-RD2(256-401)在細胞內(nèi)的同源寡聚
            3.3.3.2 TGIF1-RD2(256-401)在溶液中的同源寡聚
        3.3.4 TGIF1-RD2(256-401)與SIN3A-PAH2的相互作用
    3.4 小結(jié)
第4章 納米抗體Nb26識別黃曲霉毒素AFB1的分子機制研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料和方法
        4.2.1 材料與儀器
        4.2.2 Nb26重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.2.2.1 分子伴侶的感受態(tài)細胞制備
            4.2.2.2 目的基因的擴增
        4.2.3 Nb26的表達與純化
        4.2.4 Nb26的樣品表征
        4.2.5 Nb26的結(jié)構(gòu)解析
            4.2.5.1 Nb26的核磁實驗采集、數(shù)據(jù)處理及結(jié)構(gòu)計算
            4.2.5.2 Nb26的T₁、T₂、{¹H}-¹⁵N NOE實驗
        4.2.6 熒光滴定
        4.2.7 AFB₁與Nb26的核磁滴定
        4.2.8 holo-Nb26的主鏈化學(xué)位移歸屬
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 Nb26的可溶性表達
        4.3.2 Nb26的樣品制備
        4.3.3 Nb26的液體核磁結(jié)構(gòu)
        4.3.4 Nb26與AFB1的相互作用
    4.4 小結(jié)
第5章 總結(jié)與展望
    5.1 GAS7-SH3結(jié)構(gòu)解析及其特異性多肽配體的篩選
    5.2 TGIF1-RD2的同源寡聚及其識別輔阻遏蛋白SIN3A-PAH2的分子機制研究
    5.3 納米抗體Nb26識別黃曲霉毒素AFB1的分子機制研究
    5.4 展望
參考文獻
附錄A 國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會各氨基酸原子命名法
附錄B 實驗室常用培養(yǎng)基及緩沖液配制
附錄C T₁、T₂、{¹H}-¹⁵N NOE的處理腳本
附錄D GAS7-SH3的結(jié)構(gòu)質(zhì)量統(tǒng)計表a

附錄E Nb26的結(jié)構(gòu)質(zhì)量統(tǒng)計表^a

附錄F holo-Nb26的主鏈化學(xué)位移歸屬結(jié)果
致謝
作者簡歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號：3751643

boshi