蛋白質作為承載生物功能的重要載體,在生命活動中發(fā)揮著極其關鍵的作用。蛋白質組學的研究發(fā)現并揭示了很多重要蛋白的生理功能與調控機制,極大地促進了我們對生命活動機制的理解。目前大多數關于蛋白質的研究是基于傳統(tǒng)的生化方法,這些方法主要在溶液體系中進行,溶液體系簡單可控,給研究帶來了種種便利。然而,細胞作為組成生命體的最小單元,其復雜性遠超出了人們的想象,因此在溶液中得到的研究結果不一定能夠真實地反映蛋白在細胞內的存在狀態(tài)。此外,絕大多數細胞外溶液體系的研究結果是建立在對細胞群體研究的基礎上,忽略了細胞個體間的異質性（Cellular Heterogeneity）。這必然會導致生物信息的稀釋或丟失,甚至會得出矛盾的結論。熒光相關光譜（FCS）及其相關技術是近年來發(fā)展的單分子檢測方法,其具有靈敏度高,空間分辨率高,非侵入性檢測等優(yōu)點。這使得FCS及其相關技術非常適合在活細胞內進行蛋白濃度、擴散行為、寡聚化和相互作用等研究。同時熒光相關光譜適合在單個活細胞水平甚至是在亞細胞結構水平進行測定。本論文以熒光蛋白作為探針標記目標蛋白分子,同時構建了能夠實現在線細胞培養(yǎng)、高分辨率成像以及活細胞原位熒光相關... 

【文章來源】：上海交通大學上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【部分圖文】：

FCS系統(tǒng)示意圖

0圖 1-2 FCCS 系統(tǒng)示意圖Figure 1-2 Schematic diagram of FCCS setup2 FCCS 系統(tǒng)的結構典型的共聚焦 FCCS 系統(tǒng)如圖 1-2 所示，由兩路激光器發(fā)出的兩束不同波長激元件進行空間光合束或者是光纖耦合合束后，通過擴束鏡擴束，然后被二色鏡鏡，兩束激光聚焦于樣品中的同一位置，激發(fā)樣品聚焦體積內的兩種熒光粒子兩種不同波長的熒光信號。物鏡一般選擇高數值孔徑的水浸物鏡，在樣品中形小的檢測微區(qū)，通常小于 1 fL。由于兩種熒光粒子在溶液中作布朗運動進出檢造成微區(qū)內兩種熒光信號的漲落。由樣品產生的熒光信號被同一物鏡收集，透

圖 2-1 FCS 裝置示意圖Figure 2-1 The setup of a FCS system.2.3.13 FCS 在活細胞中的測定方法在 FCS 測定前，首先在 488 nm 激光激發(fā)下使用壓電陶瓷掃描裝置對細胞進行方向掃描。帶有 x-y 坐標信息的熒光光強信號被 FCS 系統(tǒng)收集，通過自行編寫的 M程序將這個光強信號轉換為高分辨率的細胞掃描成像圖。該圖具有 x-y 坐標位置信能夠通過控制掃描裝置，將鏡頭移動到特定的位置收集 FCS 信號。FCS 通常連續(xù)測定 5 次，每次 10s。因為在每次測定的過程中會由于光漂白造光分子數逐漸減少，所以我們取 5 次測定中的第一次數據進行濃度計算。對于擴散的計算，我們選擇后四次的測定數據，因為在第一次測定時會將那些不太運動的熒子漂白。測定得到的 FCS 數據通過 Microcal Origin 8.0 軟件進行非線性擬合。通過


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