靶向G-四鏈體熒光探針設計及其應用研究
發(fā)布時間：2021-06-19 08:54
G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基的DNA或RNA序列通過Hoogsteen氫鍵作用形成的一種特殊的核酸二級結(jié)構(gòu)。其廣泛存在于原癌基因和人端粒DNA的啟動子區(qū)域。G-四鏈體因其結(jié)構(gòu)的特殊性,使其具有潛在生物學價值,因此設計和發(fā)展G-四鏈體熒光探針尤其是適用于活細胞中G-四鏈體檢測探針,對生物醫(yī)學方面仍然具有巨大意義。圍繞靶向G-四鏈體熒光探針設計及其應用研究,主要包括以下方面:設計并合成了一款特異性識別G-四鏈體的新型菁染料探針SCY-3。通過紫外-可見光譜和熒光光譜等方法表征了它能夠特異性地與DNA G-四鏈體作用,而與其它DNA結(jié)構(gòu)和其它生物活性分子幾乎不作用。同時利用Job Plot和熒光淬滅實驗證明了其與DNA G-四鏈體的結(jié)合模式為:SCY-3通過末端堆積的方式1:1的結(jié)合在G-四鏈體的5′端。利用菁染料SCY-3能夠?qū)-四鏈體特異性識別的性質(zhì),將其應用到細胞中,并實時監(jiān)測溶酶體自噬。該探針能夠?qū)?jīng)過細胞自噬后從線粒體經(jīng)過內(nèi)吞作用進入溶酶體中的線粒體G-四鏈體進行特異性識別,隨著細胞自噬的進行,SCY-3的熒光強度逐漸增強,由此實現(xiàn)了對溶酶體自噬的實時監(jiān)測。利用菁染料MTC對G-...
【文章來源】：華北理工大學河北省
【文章頁數(shù)】：88 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
-四鏈體的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[2]
第1章文獻綜述-3-圖1G-四鏈體的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[2]Fig.1StructureandconformationofG-quadruplex[2]1.2G-四鏈體生理功能G-四鏈體主要分布在端粒和啟動子區(qū)域，各個區(qū)域的生理功能各不相同。1.2.1端粒G-四鏈體端粒是真核生物染色體末端的結(jié)構(gòu)，包括重復的DNA序列及其各種相關蛋白（庇護蛋白復合物），維持端粒必需的POT1和TRF2，保護端粒DNA免受DNA修復機制的影響，并且還可以調(diào)節(jié)哺乳動物的端粒酶活性[16]。端粒區(qū)域G-四鏈體由重復序列(TTAGGG)n組成，末端有30個突出端（200±75個核苷酸）[17-18]。端粒序列的長度隨著DNA復制而逐漸縮短，從而限制了細胞的生長和增殖[19]。圖2端粒區(qū)域G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成抑制端粒酶結(jié)合DNA引物示意圖[19]Fig.2IllustrationofindirecttelomeraseinhibitionbyG-quadruplexstabilizingagentsattelomere[19]
′突出端區(qū)域的異常加工可能會賦予細胞永生性，因此端粒G-四鏈體被認為是潛在的抑制端粒酶陽性腫瘤細胞的生物醫(yī)學靶點[20]。1.2.2啟動子區(qū)域G-四鏈體生物信息學序列分析表明在人類基因組中也有存在能夠形成G-四鏈體的富含鳥嘌呤的區(qū)域[21-22]。此外，在基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1kb處的啟動子區(qū)域富集了大量能夠形成平行G-四鏈體的序列，這些啟動子G-四鏈體形成與核酸酶超敏位點密切相關。目前推測這種基于啟動子的G-四鏈體包括c-myc[23]、VEGF[24]、HIF-1α[25]、bcl-2[26]等可能在轉(zhuǎn)錄水平上直接參與基因調(diào)控。圖3C-myc啟動子區(qū)域G-四鏈體調(diào)控基因表達示意圖[27]Fig.3IllustrationofG-quadruplexformedinc-mycpromoterregulationofthegeneexpression[27]C-myc是一個多功能轉(zhuǎn)錄因子，對調(diào)節(jié)真核細胞的生長、增殖、分化和凋亡起著至關重要的作用。在細胞中c-myc既可以充當一些參與細胞增殖基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，也可以同時充當其他參與生長停滯的基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子[27]。最近研究發(fā)現(xiàn)c-myc在細胞中的過度表達在各種人類惡性腫瘤（尤其是80%的實體瘤）中都有發(fā)生，因此促進c-myc基因的下調(diào)是一種有效的癌癥治療方法[23]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以刺激新血管的形成，從而為原位腫瘤部位提供生長充足的氧氣和營養(yǎng)，進而促進癌細胞的增殖[28]。位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游969~975個核苷酸處的激素反應序列（HRE，5′-ATACGTG-3′）可以調(diào)節(jié)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，以及靶向該基因的吡咯-咪唑聚酰胺（PIP），該序列通過干擾HRE結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（HIF-α）的結(jié)合而抑制VEGF基因表達[29]。原癌基因c-kit啟動子編碼酪氨酸激酶受體，其功能是調(diào)節(jié)控制細胞的生長和增殖的信號[30]。格列衛(wèi)（伊馬替尼）是一種有效的c-kit激酶活性的體外和體內(nèi)抑制劑，在臨
本文編號：3237509
【文章來源】：華北理工大學河北省
【文章頁數(shù)】：88 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
-四鏈體的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[2]
第1章文獻綜述-3-圖1G-四鏈體的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[2]Fig.1StructureandconformationofG-quadruplex[2]1.2G-四鏈體生理功能G-四鏈體主要分布在端粒和啟動子區(qū)域，各個區(qū)域的生理功能各不相同。1.2.1端粒G-四鏈體端粒是真核生物染色體末端的結(jié)構(gòu)，包括重復的DNA序列及其各種相關蛋白（庇護蛋白復合物），維持端粒必需的POT1和TRF2，保護端粒DNA免受DNA修復機制的影響，并且還可以調(diào)節(jié)哺乳動物的端粒酶活性[16]。端粒區(qū)域G-四鏈體由重復序列(TTAGGG)n組成，末端有30個突出端（200±75個核苷酸）[17-18]。端粒序列的長度隨著DNA復制而逐漸縮短，從而限制了細胞的生長和增殖[19]。圖2端粒區(qū)域G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成抑制端粒酶結(jié)合DNA引物示意圖[19]Fig.2IllustrationofindirecttelomeraseinhibitionbyG-quadruplexstabilizingagentsattelomere[19]
′突出端區(qū)域的異常加工可能會賦予細胞永生性，因此端粒G-四鏈體被認為是潛在的抑制端粒酶陽性腫瘤細胞的生物醫(yī)學靶點[20]。1.2.2啟動子區(qū)域G-四鏈體生物信息學序列分析表明在人類基因組中也有存在能夠形成G-四鏈體的富含鳥嘌呤的區(qū)域[21-22]。此外，在基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1kb處的啟動子區(qū)域富集了大量能夠形成平行G-四鏈體的序列，這些啟動子G-四鏈體形成與核酸酶超敏位點密切相關。目前推測這種基于啟動子的G-四鏈體包括c-myc[23]、VEGF[24]、HIF-1α[25]、bcl-2[26]等可能在轉(zhuǎn)錄水平上直接參與基因調(diào)控。圖3C-myc啟動子區(qū)域G-四鏈體調(diào)控基因表達示意圖[27]Fig.3IllustrationofG-quadruplexformedinc-mycpromoterregulationofthegeneexpression[27]C-myc是一個多功能轉(zhuǎn)錄因子，對調(diào)節(jié)真核細胞的生長、增殖、分化和凋亡起著至關重要的作用。在細胞中c-myc既可以充當一些參與細胞增殖基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，也可以同時充當其他參與生長停滯的基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子[27]。最近研究發(fā)現(xiàn)c-myc在細胞中的過度表達在各種人類惡性腫瘤（尤其是80%的實體瘤）中都有發(fā)生，因此促進c-myc基因的下調(diào)是一種有效的癌癥治療方法[23]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以刺激新血管的形成，從而為原位腫瘤部位提供生長充足的氧氣和營養(yǎng)，進而促進癌細胞的增殖[28]。位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游969~975個核苷酸處的激素反應序列（HRE，5′-ATACGTG-3′）可以調(diào)節(jié)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，以及靶向該基因的吡咯-咪唑聚酰胺（PIP），該序列通過干擾HRE結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（HIF-α）的結(jié)合而抑制VEGF基因表達[29]。原癌基因c-kit啟動子編碼酪氨酸激酶受體，其功能是調(diào)節(jié)控制細胞的生長和增殖的信號[30]。格列衛(wèi)（伊馬替尼）是一種有效的c-kit激酶活性的體外和體內(nèi)抑制劑，在臨
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