纖維素是自然界中最豐富的碳水化合物,可被纖維素酶水解成可發(fā)酵的糖,是理想的化石燃料的可持續(xù)的替代能源。纖維素酶在木質纖維素材料降解中起著關鍵作用,目前已經有很多的纖維素酶被開發(fā)利用,但工業(yè)應用需要酶具有一些獨特的性質,如耐高溫、耐酸堿等。這就需要我們一方面不斷開發(fā)新酶源,另一方面加深對酶催化過程的了解,不斷改造出具有新功能的酶。隨著分子生物學和結構生物等學科的不斷進步,對纖維素酶的催化機理的研究和新酶源的開發(fā)逐步發(fā)展為兩個重要的研究前沿方向。本論文從以上兩個方面入手分別進行纖維素酶系PT-box Linker的功能研究和新型糖苷酶的性質研究。論文第一部分選取來源于嗜熱細菌Acidothermus cellulolyticus 11B的內切纖維素酶AcCel12B為研究對象,利用分子生物學手段對其linker進行改造。AcCel12B由一個催化結構域(CD)和一個纖維素結合結構域(CBM)組成,通過48個氨基酸長的linker區(qū)域將其連接。AcCel12B的linker區(qū)域包含一段PT-box,PT-box通過兩個不保守區(qū)域分別連接CD和CBM。AcCel12B的PT-box顯著的特點是被甘氨酸分成兩部分,兩部分的氨基酸序列以甘氨酸為軸呈現(xiàn)對稱排列。為了研究PT-box在纖維素水解中的功能,我們將PT-box的每個部分定義為一個PT-box結構單元,然后重新設計PT-box結構單元的數目來研究PT-box結構對酶功能的影響。論文通過分子生物學的方法,成功構建了纖維素酶AcCel12B和三個含有不同數目PT-box的AcCel12B的突變體(沒有或1-3個PT-box),并成功的用工程菌進行了的表達并完成了純化。通過對纖維素酶AcCel12B和三個突變體性質研究,發(fā)現(xiàn)纖維素酶對Avicel和RAC的活性隨著PT-box數目的增加而增加。AcCel12B和所有突變體對可溶性纖維素(CMC)的活性沒有顯著差異。通過研究酶對RAC水解的時間進程,發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象,纖維素酶對固體RAC的活性隨著PT-box數目的增加而增加,而對水解產生的可溶性纖維素的活性沒有顯著差異。為了探究不同PT-box數目的纖維素酶對固體纖維素水解存在差異的原因,我們研究了纖維素酶AcCel12B和三個突變體對固體纖維素的吸附和解吸附情況,結果發(fā)現(xiàn)AcCel12B及其突變體從RAC和Avicel的解吸附有著顯著的不同。野生型和突變體AcCel12B從纖維素中解吸的能量隨著PT-box結構單位的數量而降低,而AcCel12B和突變體對RAC和Avicel的吸附情況沒有明顯的差異。這種規(guī)律符合其對RAC和Avicel的水解規(guī)律。根據以上研究,我們得出結論,含有更多PT-box的AcCel12B更容易從底物上解吸附,從而有更多的機會去建立新的催化水解位點,從表觀上顯示出更高的催化水解活力。所以纖維素酶中PT-box的數量影響酶的解吸附過程,這也是AcCel12B和其突變體對Avicel和RAC水解活力存在差異的原因。論文第二部分是從Acidothermus cellulolyticus 11B ATCC 43068中成功克隆出有一個新的β-糖苷水解酶基因。成功構建了重組工程菌的表達系統(tǒng),獲得了高純度的重組β-糖苷水解酶(AcBg)。β-糖苷水解酶是纖維素降解過程中重要的酶,到目前為止,已發(fā)現(xiàn)的β-糖苷水解酶有很多,但有著高濃度鹽耐受的酶很少,還能被多種單糖增強的酶更為稀少,然而降解纖維素工業(yè)有些需要在高濃度鹽和糖的條件下進行,這要求酶有很高的鹽和糖耐受性。本文發(fā)現(xiàn)的β-糖苷水解酶有著高濃度鹽耐受,能被多種單糖增強,這種酶在已發(fā)現(xiàn)各種β-糖苷水解酶中并不多見。通過序列比對我們發(fā)現(xiàn),該酶屬于糖苷水解酶第一家族,最適pH和溫度分別為7.0和70℃。在最佳條件下,AcBg對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)和纖維二糖的活力分別為290 U/mg和33 U/mg。根據HPLC分析,AcBg是從底物的非還原端順序水解寡糖以產生葡萄糖單元。并且發(fā)現(xiàn)該酶能被一價陽離子增強酶活力,在5M NaCl或KCl條件下,酶活力增大約2.6倍和2.2倍,在接近飽和鹽濃度條件下,酶的活力仍然是未加鹽的2倍以上。二價金屬離子(如Ni~(2+),Zn~(2+),Fe~(2+),Mn~(2+)等)不同程度地抑制了酶的活性,其他二價金屬離子對酶活性沒有明顯影響。AcBg還顯示出單糖激活的性質。0.1M的α-甲基-D-葡萄糖能增強酶活力約1.4倍,0.2 M的D-葡萄糖增強β-葡萄糖苷酶的活性約1.9倍,1.0 M的木糖增強酶活力約1.9倍。我們測定不同葡萄糖濃度下的催化動力學和結構變化,結果表明葡萄糖能降低了酶的底物親和力,并引起酶的構象變化。綜上所述,本文發(fā)現(xiàn)的β-糖苷水解酶AcBg在工業(yè)應用方面和催化機理方面都有很強的研究價值。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：O629.8
【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 纖維素和纖維素酶
        1.1.1 生物能源簡介
        1.1.2 纖維素簡介
        1.1.3 纖維素酶的簡介
    1.2 纖維素酶的Linker
        1.2.1 Linker區(qū)域
        1.2.2 PT-box結構
    1.3 β-糖苷酶
        1.3.1 β-糖苷酶簡介
        1.3.2 β-糖苷酶的應用
    1.4 立題依據和實驗設計
    1.5 參考文獻
第二章 纖維素內切酶Linker突變體的設計、構建、表達和純化.
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株和質粒
        2.2.2 溶液和培養(yǎng)基
        2.2.3 實驗試劑
        2.2.4 實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 AcCel12B的構建
        2.3.2 突變體AcCel12B-PT0的構建
        2.3.3 突變體AcCel12B-PT1和AcCel12B-PT3的構建
        2.3.4 AcCel12B和突變體表達純化
    2.4 結果與討論
        2.4.1 AcCel12B的Linker突變體設計
        2.4.2 AcCel12B的Linker突變體的構建
        2.4.3 AcCel12B的Linker突變體的表達和純化
    2.5 小結
    2.6 參考文獻
第三章 纖維素內切酶Linker突變體的性質研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
    3.3 實驗方法
        3.3.1 AcCel12B和突變體的酶學性質實驗
        3.3.2 AcCel12B和突變體對RAC水解的時間進程實驗
        3.3.3 AcCel12B和突變體的吸附和解吸附實驗
    3.4 結果與討論
        3.4.1 AcCel12B和突變體的酶學性質
        3.4.2 AcCel12B和突變體對RAC水解的時間進程
        3.4.3 AcCel12B和突變體的吸附
        3.4.4 AcCel12B和突變體的解吸附
    3.5 小結
    3.6 參考文獻
第四章 新型糖苷酶的性質研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
    4.3 實驗方法
    4.4 結果和討論
        4.4.1 AcBg序列比對分析結果
        4.4.2 AcBg的表達及純化
        4.4.3 AcBg的酶學性質表征
        4.4.4 單糖對AcBg的影響
    4.5 小結
    4.6 參考文獻
創(chuàng)新點
展望
作者簡介
已發(fā)表的論文
博士期間參加的學術會議
致謝

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本文編號：2876278