近年來,隨著全球獸藥殘留問題日趨嚴峻,各類新型檢測技術得到了迅猛發(fā)展。在這些技術中,基于核酸適體的標記型電化學傳感器表現(xiàn)出操作簡單、無試劑化、可重復使用、在復雜基質(zhì)中工作能力強且可與生物芯片相兼容等諸多優(yōu)點,易于實現(xiàn)微型化和在線監(jiān)測,與其他技術相比,通過基礎功能參數(shù)性能的改良,將更有利于實際應用化,極具研究開發(fā)價值,是未來發(fā)展的重要方向之一。本文以核酸DNA適體-卡那霉素A(KMY-A)特異性作用體系為研究對象,通過探針自組裝結(jié)構變化,定向設計并構建了三類分別基于單、雙和三探針組合5種不同構型的電化學傳感器,系統(tǒng)研究了構型變化對改善靈敏度的影響,成功實現(xiàn)了通過構型變化調(diào)控和有效提高傳感器信號增益率(SE%)或絕對檢測信號值(DS)和基礎功能如檢測限、響應速度和選擇性等參數(shù)性能的目標。具體工作分述如下:一、基于目標物誘導構型變化信號機制構建了一種單探針體系傳感器(S-1)。實驗優(yōu)化了探針密度、支持溶劑鏈長度、工作介質(zhì)離子強度和檢測溫度4個影響傳感器構建和工作效率的關鍵參數(shù)。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下SE%為226.1±8.0%;線性范圍為1.0μM~1.0m M,檢測限為0.33μM;對其他5種非同類結(jié)構抗生素分子表現(xiàn)出較好的區(qū)分度,區(qū)分系數(shù)介于-0.002~0.019之間,對同類結(jié)構同系物卡那霉素B(KMY-B)表現(xiàn)出一定的區(qū)分度,區(qū)分系數(shù)為0.90;響應時間為~15 s,顯示出超快的傳感速度;用于三類目標物殘留常見實際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價,SE%值分別為116.2±7.2、172.7±8.7和81.7±5.8,表現(xiàn)出較好的工作性能。二、針對S-1因捕獲信號探針(CSP-MB)自由彈性擺動導致背景電流相對較高的缺點,通過引入支撐輔助探針(AP)設計并構建了基于目標物誘導取代反應信號機制的雙探針體系傳感器(S-2)。該傳感器借助輔助雙鏈作用有效限制了CSP的自由彈性擺動,從而降低背景電流,相對提高檢測靈敏度。實驗優(yōu)化了AP和CSP的比例、混合探針濃度、AP/CSP雙鏈位置和AP長度4個影響傳感器構建和工作效率的關鍵參數(shù)。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下SE%為502.1±26.0%;線性范圍為5.0 n M~10.0μM,檢測限為1.7 n M;對其他5種非同類結(jié)構抗生素分子區(qū)分系數(shù)介于-0.002~0.009之間,對KMY-B區(qū)分系數(shù)為0.84;響應時間為~240 s;用于實際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價,其SE%值分別為176.5±15.2%、407.4±21.0%和126.9±14.0%。除響應速度外,該傳感器的總體性能好于S-1。三、可以預測,呈莖環(huán)變化構型帶動亞甲基藍(MB)標記物的效率會高于CSP轉(zhuǎn)變?yōu)镃SP/KMY-A復合物變化構型,有利于提高SE%,進而改善靈敏度�；诖�,以適體為捕獲探針(CP),一段自身呈莖環(huán)型結(jié)構DNA為輔助兼信號探針(ASP),設計并成功構建了基于目標物誘導莖環(huán)“開關”信號機制的雙探針體系傳感器(S-3)。實驗優(yōu)化了CP和ASP的比例、混合探針濃度、CP/ASP雙鏈長度和檢測溫度4個影響傳感器構建和工作效率的關鍵參數(shù)。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下SE%為801.1±32.0%;線性范圍為2.5 n M~10.0μM,檢測限為0.83 n M;對其他5種非同類結(jié)構抗生素分子區(qū)分系數(shù)介于0.0005~0.0071之間,對KMY-B區(qū)分系數(shù)為0.64;響應時間為~60 s;用于實際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價,其SE%值分別為342.9±15.2%、665.4±21.0%和260.3±18.2%。四、前三種傳感器均采用MB標記探針限定在電極表面的方式。該方式因?qū)B固定在電極表面一定范圍內(nèi),背景電流難以有效降低。為解決這一問題,借助信號探針(SP)游離的思路設計并構建了基于目標物誘導SP轉(zhuǎn)移信號機制的“雙撐型”三探針體系傳感器(S-4)。在該傳感器結(jié)構中,CP/AP雙鏈采用“雙撐”方式共嫁接于金電極表面,SP游離于溶液體系。實驗優(yōu)化了CP和AP比例、混合探針濃度、SP濃度、AP長度和檢測溫度5個影響傳感器構建和工作效率的關鍵參數(shù)。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下DS值為0.81±0.08μA,SE%為35000±6250%;線性范圍為100 p M~1.0μM,檢測限為30 p M;對其他5種非同類結(jié)構抗生素分子區(qū)分系數(shù)介于-0.004~0.0021之間,對KMY-B區(qū)分系數(shù)為0.49;響應時間為~15 min;用于實際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價,其DS值分別為純工作介質(zhì)中DS值的44.4±3.6%、48.1±4.2%和26.0±2.8%。五、在S-4結(jié)構上進行適當變化,將CP/AP雙鏈采用“單撐”方式即僅AP嫁接于金電極表面構建了S-5傳感器。該傳感器呈現(xiàn)出與S-4完全相反的雜交阻力減小的作用模式,有效提高了傳感效率,改善了傳感綜合性能。在優(yōu)化條件下,該傳感器用于KMY-A檢測,添加2.0 m M濃度下DS值為1.98±0.12μA,SE%為70000±8850%;線性范圍為10 p M~1.0μM,檢測限為3.3 p M;對其他5種非同類結(jié)構抗生素分子區(qū)分系數(shù)介于-0.0012~0.0005之間,對KMY-B區(qū)分系數(shù)為0.47;響應時間為~9 min;用于實際樣品牛奶、自來水和血清的分析評價,其DS值分別為純工作介質(zhì)中DS值的46.2±3.2%、65.0±4.0%和40.1±2.8%。
【學位單位】：哈爾濱理工大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：O657.1
【部分圖文】：

圖 1-1 適體篩選技術流程圖Fig. 1-1 Scheme for the SELEX1.2.3 傳感器分類與結(jié)構電化學技術被廣泛地用于食品和水中污染物的檢測[41-45]。因其檢測成本低、操作簡單快速、攜帶方便、易微型化和實現(xiàn)在線監(jiān)測，具有極好的應用化和商業(yè)化前景，與其他技術相比，顯示出明顯的優(yōu)勢。根據(jù)輸出參數(shù)如阻抗、電流和電位，電化學適體傳感器一般可對應分為三種類型，即阻抗型傳感器、電流型（安培/伏安）傳感器和電位（電勢）型傳感器。這些檢測技術與適體篩選技術相結(jié)合，極大地促進了適體傳感器的發(fā)展，為解決復雜基質(zhì)樣品中各類污染物分析提供了可行解決方案[46-50]。電化學適體傳感器一般結(jié)構如圖 1-2 所示。全部系統(tǒng)主要由敏感分子識別元件和轉(zhuǎn)換器兩部分組成。轉(zhuǎn)換器部件一般又包括修飾層、電極基底和電學系統(tǒng)三部分。用作修飾層的物質(zhì)如有機分子、導電聚合物和納米材料等起著適體和基底的連接作用，可有效改善電子傳遞效率實現(xiàn)電信號的擴增。用作基底的一般是由不同材料做成的電極，如金電極（AuE）、玻碳電極（GCE）、銦錫氧

圖 1-2 電化學適體傳感器結(jié)構示意圖Fig.1- 2 the schematic diagram of E-aptasensor construction1.3 卡那霉素電化學適體傳感器研究進展卡那霉素是氨基糖苷類抗生素的重要亞類之一，廣泛應用于治療革蘭陽性和革蘭陰性菌引起的嚴重感染，在臨床和畜牧中均有應用。在實際生產(chǎn)和生活中，過度使用和濫用以及對其廢棄物不合理處置等常會導致食品如牛奶、飲用水和人體內(nèi)含有一定的殘留。長期接觸或食用含有卡那霉素殘留的物品或食品可引起人耳毒性、腎毒性和耐藥性，造成人體正常生理功能紊亂，危害人體健康[53]。為提前預防并及時消除這些潛在的危害影響，建立既快速又準確的分析方法實現(xiàn)對卡那霉素殘留水平的監(jiān)測具有重要意義[54]。近 5 年來，隨著適體篩選技術的發(fā)展和卡那霉素適體的報導，采用核酸適體為分子識別元件的電化學卡那霉素適體傳感器的研究引起了人們廣泛關注，共有 13 個[55-67]相關工作進行了報導，具體參數(shù)總結(jié)對比列于表 1-1，分別為采用阻抗技術和三種伏安技術即差分脈沖伏安技術（DPV）、方波伏安技術（SWV）

圖 1-3 卡那霉素適體傳感器的表面修飾和構建示意圖[55]Fig.1- 3 Schematic diagram of surface modification and fabrication of kanamycin aptasensor[5.3.2 電流型適體傳感器.3.2.1 基于 LSV 技術 LSV 是一種電化學伏安法技術。其做法是在電解池和電極之間施加一個線性電位掃描（電位與時間為線性關系）。在具體測試中現(xiàn)單次和多次掃描。依據(jù)測定獲得的電流-電位曲線上峰電流與目標物之間性關系可進行定量分析，比較適合于發(fā)生吸附反應的測定，因而在傳感器一定的應用[70]。韓國釜山國立大學化學系 Zhu Y[56]研究組采用在金電極表飾導電聚合物聚-[2,5-二-(2-噻吩基)-1H-吡咯-1-(p-苯甲酸)]（poly-DPB）來電子傳遞效率并借助 EDC:NHS 化學反應實現(xiàn)適體耦合，構建了基于 LSV的適體傳感器（圖 1-4）。DPB 在金電極表面的自組裝過程采用掃描電鏡（TEM術和紫外-可見光譜（UV-vis）進行觀察，適體修飾過程以光電子能譜（XP術和電化學阻抗（EIS）技術進行表征，采用 LSV 技術進行定量測定。在條件下，該傳感器對目標物檢測獲得了 0.05-9.0 μM 的線性范圍和 9.4±0.4 n檢測限。
【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 察冬梅;;淺議靈敏度、檢出限和測定限[J];大學化學;2011年04期

本文編號：2870626