運(yùn)用CAR T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法)治療腫瘤的方法是近年來發(fā)展最為迅速的一種腫瘤免疫新療法。CAR T細(xì)胞療法能克服局部免疫抑制,對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷不受MHC(major histocompatibility complex)限制等優(yōu)勢(shì),但同時(shí)也必須面對(duì)在治療過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子釋放綜合癥(CRS)、脫靶效應(yīng)和神經(jīng)毒性等因素的困擾。因此CAR T細(xì)胞治療技術(shù)的有效性和安全性還需要研究人員去嚴(yán)格把控。由于CAR T生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的多樣性使得CAR T產(chǎn)品中的雜質(zhì)復(fù)雜多樣,即使微量的雜質(zhì)殘留都可能會(huì)在人體中產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng),其中DNA殘留是最主要的雜質(zhì)。殘留的外源DNA可能造成插入突變、導(dǎo)致抑癌基因失活、癌基因被激活等,而至今還沒有一種全面、準(zhǔn)確、合規(guī)的檢測(cè)方法能評(píng)價(jià)CAR T中間產(chǎn)品—慢病毒載體中的DNA殘留。因此本文將采用熒光染料法和qPCR法對(duì)慢病毒載體生產(chǎn)和純化工藝中的樣品進(jìn)行DNA殘留檢測(cè)。PicoGreen熒光染料法檢測(cè)DNA殘留具有檢測(cè)快速、成本低的特點(diǎn),但其靈敏度不高,對(duì)于特定DNA殘留如SV40和E1A等也缺乏有效的檢測(cè)方法,而qPCR法雖具備特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),卻存在只能檢測(cè)宿主細(xì)胞(CHO、Ecoli、Vero),不能檢測(cè)293T細(xì)胞總DNA殘留的缺點(diǎn)。為了能更好的完善CAR T生產(chǎn)純化工藝,全面檢測(cè)慢病毒載體中的DNA殘留,為將來CAR T技術(shù)更好地運(yùn)用于臨床實(shí)驗(yàn)當(dāng)中去。本文先運(yùn)用熒光染料法建立了三套不同的檢測(cè)范圍和靈敏度的總DNA殘留檢測(cè)方法,并針對(duì)于實(shí)際慢病毒載體生產(chǎn)樣品的濃度,選取25~800 ng/mL檢測(cè)范圍的檢測(cè)方法進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、稀釋線性和耐用性的驗(yàn)證。隨后運(yùn)用qPCR法通過探針引物的選擇、優(yōu)化,DNA抽提效率的考察后建立了針對(duì)于SV40、E1A DNA殘留檢測(cè)的方法,并對(duì)這兩種方法進(jìn)行了準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、和耐用性的驗(yàn)證,通過聯(lián)合運(yùn)用熒光染料法和qPCR法對(duì)慢病毒載體中的DNA殘留進(jìn)行全面、準(zhǔn)確、快速、高效的檢測(cè)。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O657.3;TQ460.72
【部分圖文】：

原作為內(nèi)源性抗原可以由腫瘤細(xì)胞自身的 HLA-I類分子直接提呈給 CD8+CTL可以由其他抗原提呈細(xì)胞（antigenpresentingcell，APC）提呈。眾所周知 CD8+CT胞的活化需要雙信號(hào)刺激，第一信號(hào)則是由識(shí)別抗原多肽分子（HLA）復(fù)合生，而這個(gè)識(shí)別過程具有雙特異性，即胞外可變域特異性識(shí)別腫瘤抗原表位此同時(shí) CD8+分子需特異性地識(shí)別自身 HLA-1 分子的多態(tài)性部位，唯有雙特識(shí)別才能為 CTL 活化提供完整的第一信號(hào)。而我們知道腫瘤細(xì)胞的 HLA-1 表達(dá)通常是下調(diào)的，這就造成了 C8+分子無(wú)法特異性地識(shí)別 HLA-1 分子，從成了 MHC（MHCmajor histocompatibility complex）限制[1]，腫瘤細(xì)胞免于被的細(xì)胞免疫系統(tǒng)所發(fā)覺和殺傷，從而使得 CTL 及相關(guān)的細(xì)胞免疫治療的抗腫用受到了很大的限制。而 CAR T 技術(shù)作為細(xì)胞免疫治療（Cellular Immunothera代表，它可以不受 MHC 的限制作用，它能夠只識(shí)別腫瘤抗原而不需要通過 HLA-1 分子就能活化 CTL，能夠使 CTL 細(xì)胞本身表達(dá)腫瘤抗原受體而不LA-1 類分子的限制，從而繞過樹突狀細(xì)胞 DC 直接識(shí)別腫瘤細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行,其主要原理如圖 1 所示。

上海交通大學(xué)工程碩士學(xué)位論文AR T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體 T 療法），其原理就是將胞外特異性腫瘤抗原識(shí)別區(qū)、鉸鏈、跨膜區(qū)以及胞傳導(dǎo)域四部分拼接后，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體轉(zhuǎn)染方式將目的基因效應(yīng)細(xì)胞，并使表達(dá)抗原特異性的效應(yīng)細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后回輸注給種細(xì)胞免疫治療技術(shù)。CAR T 具體的工作流程為：通過采集患者外周靜離出的 T 細(xì)胞，使其在多因子細(xì)胞誘導(dǎo)下大量擴(kuò)增，并引入靶向腫瘤抗抗原受體（CAR）。通過 CAR 的修飾可使 T 細(xì)胞在獲得靶向殺傷能力的得更強(qiáng)的增殖及抗凋亡的能力，其腫瘤殺傷作用的發(fā)揮也不會(huì)受到主要組復(fù)合體（MHC）的限制[1]，最后通過靜脈或皮內(nèi)注射等手段回輸入患者到殺傷腫瘤的目的，具體流程見圖 2。由于該 T 細(xì)胞腫瘤靶向的持續(xù)擴(kuò)和殺傷活性，保證了其對(duì)腫瘤細(xì)胞造成持續(xù)有效的殺傷力，從而使病人的治愈。

2.1 方法概述本方法采用 PicoGreen 熒光染色法。PicoGreen 是一種高靈敏度的雙鏈 DNA染料[47,48]，它能直接與 DNA 雙鏈結(jié)合形成復(fù)合物，結(jié)合后的熒光強(qiáng)度也大大增強(qiáng)。雙鏈 DNA 直接與 DNA 熒光染料分子結(jié)合后，經(jīng)帶有熒光功能的酶標(biāo)儀激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號(hào)，其含量與熒光值成正比，原理如圖 3 所示。其具體工作流程為：先將供試品進(jìn)行合適的稀釋，再與 PicoGreen 染料等比混合，避光孵育，最后用酶標(biāo)儀記錄 OD 480/520 nm 熒光值，并使用線性法擬合回歸模型繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2>0.99），計(jì)算殘留的總 DNA 含量。PicoGreen 染色法可以排除蛋白、鹽、聚乙二醇、氯仿、尿素、瓊脂糖及乙醇對(duì)其的影響，單鏈 DNA、RNA 對(duì)其樣品檢測(cè)的結(jié)果影響也很小[ 49,50]。它的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)方便、耗時(shí)短、成本低廉，可應(yīng)用于高通量檢測(cè)篩選，特別適用于 DNA 含量相對(duì)高的樣品，比如未經(jīng)過純化工藝的上游樣品，因此我們?cè)诠に囬_發(fā)純化過程中經(jīng)常采用 PicoGreen 熒光染色法對(duì)慢病毒載體工藝樣品進(jìn)行檢測(cè)。目前該方法也已納入《中國(guó)藥典》[51]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2814250