【摘要】：蛋白質(zhì)的構象轉變一直是科學中的基本問題。有關蠶絲及其絲蛋白的研究表明,絲纖維優(yōu)異的力學性能與其構象有著密切的關系。β-折疊構象與絲纖維的強度有關,而α-螺旋和無規(guī)卷曲結構的含量與絲纖維的彈性有關。在一定的環(huán)境,如有機溶劑、溫度、金屬離子、pH值的變化及剪切力等條件誘導下,絲蛋白構象都會發(fā)生變化,因而研究絲素蛋白構象轉變的過程有助于深入了解蠶絲優(yōu)越的綜合力學性能。二維相關光譜技術(2D-COS)已被廣泛用于蛋白質(zhì)構象轉變的研究中。這些研究基本上都是利用了二維相關光譜技術的所謂兩大優(yōu)勢:1)可提高光譜的分辨能力;2)可得出外擾因素下光譜信號變化的“序列順序”。結果是,幾乎所有運用二維相關光譜來進行蛋白質(zhì)構象轉變過程的研究,都會得出相似的結論,即蛋白構象轉變不是一個協(xié)同的的過程,而是包含了序列順序。但是,我們已有的理論研究和實驗結果表明,通過二維相關光譜技術中的“序列順序”規(guī)則得出的序列順序結果并不具有普適性。同時,二維相關分析技術的第一個優(yōu)勢:提高光譜的分辨能力也具有很大的不確定性。針對上述問題,本論文以絲素蛋白為研究對象,結合原位紅外光譜分析方法(二階導數(shù)、傅里葉自去卷積、曲線擬合)和二維紅外相關光譜技術,系統(tǒng)研究了絲素蛋白二級結構在不同環(huán)境擾動下的轉變過程,希望解決一個基本的科學問題:環(huán)境擾動誘導的絲素蛋白二級結構或性質(zhì)的變化過程是完全協(xié)同還是存在一定的序列順序,以期完善廣義二維相關光譜,并促進其在蛋白質(zhì)科學及其他領域的合理使用。另外,基于化學因素誘導絲素蛋白構象轉變的原理,我們擬通過調(diào)控絲素蛋白構象來調(diào)控絲素蛋白改性的聚乙烯醇復合膜的性能,從而為這一純粹的基礎研究找到應用背景。論文的具體安排與研究內(nèi)容如下:1、溫度誘導絲素蛋白構象轉變的紅外光譜研究我們首先獲得了在溫度區(qū)間130℃至220℃變溫過程中絲素蛋白膜的原位紅外光譜圖。然后結合二維相關光譜、傅里葉自去卷積和二階導數(shù)的分辨結果,利用曲線擬合技術對再生絲素蛋白在130-220℃升溫過程中的二級結構變化情況進行分析,得到絲素蛋白中各二級結構對應的峰強度及其峰面積變化的具體信息。最后將原位光譜分析的結果與二維相關分析技術得到的“序列順序”結果進行對比,發(fā)現(xiàn),二維相關分析得出的絲素蛋白膜在130-220℃溫度區(qū)間內(nèi)的序列順序(β-折疊(低波數(shù),1630 cm~(-1))無規(guī)卷曲構象(1650 cm~(-1))非酰胺C=O(1720 cm~(-1))α-螺旋構象(1660 cm~(-1)))結論超乎常識,是值得懷疑的。而采用原位紅外光譜分析得出的序列順序結果表明,絲素蛋白主要的二級結構包括α-螺旋、β-轉角、無規(guī)卷曲和β-折疊(高波數(shù))在低溫下幾乎同時發(fā)生轉變,而非酰胺C=O(1724 cm~(-1))和β-折疊(低波數(shù),1629 cm~(-1))在高溫下才開始發(fā)生轉變。從原位紅外譜圖分析中我們還能看出在升溫過程中,200℃之前絲蛋白的構象由α-螺旋和無歸卷曲逐漸轉變?yōu)棣?轉角、β-折疊和非酰胺C=O。200℃之后,部分β-轉角構象被破壞,逐漸轉變?yōu)棣?折疊和非酰胺結構。另外,我們比較了不同狀態(tài)下絲素蛋白在溫度區(qū)間(30-80℃)內(nèi)的構象轉變,結果顯示,水在絲素蛋白構象轉變中起到重要作用。最后結合熱重-紅外聯(lián)用儀、固體核磁共振和紅外光譜對絲素蛋白的熱降解行為進行了研究,絲素蛋白膜在高溫處理時,會發(fā)生降解,生成CO_2和NH_3等小分子。絲素蛋白的構象由無規(guī)卷曲/α-螺旋結構轉變?yōu)棣?折疊構象。2、化學因素誘導絲素蛋白構象轉變的紅外光譜研究研究了醇類有機溶劑、不同pH值和不同鈣離子含量三種化學因素誘導絲素蛋白構象的轉變。1)甲醇、乙醇和不同含量乙醇誘導下絲素蛋白各二級結構同時發(fā)生轉變,并不存在先后序列順序。絲素蛋白在甲醇、乙醇和正丙醇誘導下二級結構都是由無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-轉角向β-折疊構象轉變。絲素蛋白在三種醇溶劑中的轉變速率為甲醇乙醇正丙醇,其中甲醇能夠誘導絲素蛋白形成最快且最多量的β-折疊構象,正丙醇中絲素蛋白構象轉變速率最慢。2)不同pH值誘導下絲素蛋白的構象同時發(fā)生轉變,不存在先后序列順序。絲素蛋白在不同pH值誘導下二級結構隨pH升高時由β-折疊和β-轉角逐漸轉變?yōu)棣?螺旋和無規(guī)卷曲構象,即弱酸性條件下更有利于β-折疊的生成,而弱堿性條件下更有利于α-螺旋和無規(guī)卷曲的穩(wěn)定。3)基于1)中乙醇誘導的絲素蛋白分散體中加入不同量的鈣離子,分散體由渾濁變得澄清。鈣離子存在時,更有利于絲素蛋白各二級結構中α-螺旋和無規(guī)卷曲的形成,隨著鈣離子濃度的增加,β-折疊和β-轉角構象逐漸轉變?yōu)棣?螺旋和無規(guī)卷曲構象。這一研究有助于理解氯化鈣溶液能夠溶解蠶絲制備再生絲素蛋白水溶液,從而制備一系列絲素蛋白基材料。3、壓力誘導絲素蛋白構象轉變的紅外光譜研究采用時間分辨光譜技術研究了壓力對絲素蛋白濕膜中絲素蛋白構象的影響。壓力無法誘導絲素蛋白干膜發(fā)生構象的轉變。但是當絲素蛋白膜中含有部分重水時,壓力能夠誘導絲素蛋白由無規(guī)卷曲、a-螺旋和β-轉角構象向β-折疊結構轉變;在恒定壓力和恒定的重水含量下,絲素蛋白濕膜中絲蛋白構象轉變隨時間分辨的過程可以分為三個階段。在初始階段,無規(guī)卷曲、a-螺旋和β-轉角構象轉變?yōu)棣?折疊構象;第二階段,無規(guī)卷曲和β-轉角構象轉變?yōu)棣?折疊(1618 cm~( 1))和a-螺旋(1647 cm~( 1),~5%);最后階段,絲素蛋白各二級結構含量沒有明顯的變化,屬于平衡階段。4、絲素蛋白增強聚乙烯醇復合膜的制備及性能研究基于乙醇和酸性溶液誘導絲素蛋白構象轉變的原理制備了絲素蛋白/聚乙烯醇交聯(lián)復合膜,以期通過調(diào)控絲素蛋白構象來調(diào)控復合膜的性能。為減少絲素蛋白和聚乙烯醇之間的相分離,采用戊二醛作為二者的交聯(lián)劑。比較了復合膜經(jīng)過醇溶液和酸性溶液處理后絲素蛋白構象、復合膜的力學性能、相分離程度和最大熱失重速率隨溫度的變化。戊二醛交聯(lián)后的SF/PVA復合膜相分離程度明顯較少,能夠得到完整均勻的復合膜。乙醇溶液處理后的復合膜中,絲素蛋白分子鏈轉變?yōu)棣?折疊構象,使分子排布更加緊密,構象更加規(guī)整,從而更進一步地提高SF/PVA交聯(lián)復合膜的力學性能。酸性溶液處理的復合膜中,絲素蛋白分子鏈也能重排形成部分β-折疊結構,但是相對含量遠比乙醇誘導為β-折疊構象的含量低,因此,酸性溶液處理的復合膜的力學性能低于乙醇處理的SF/PVA交聯(lián)復合膜。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O629.73
【圖文】：

圖 1-1 一根桑蠶繭絲的 SEM 圖像[20]Fig. 1-1 SEM image of a silkworm silk5 wt.%左右的雜質(zhì)[17]，除了 C、O、H 和 N 等蛋白

圖 1-2 桑蠶腺體示意圖[51]Fig. 1-2 Schematic diagram of mulberry silkworm gland前部；am—中部前區(qū)；amm—中部中區(qū)前端；p—絲腺中部后區(qū)；pmm—中部中區(qū)后端；F—鱗翅目動物的菲

有科研工作者總結出蠶絲形成的機理[52]，如圖1-3 所示，桑蠶吐絲的驅(qū)動力是由外部的拉力和腺體內(nèi)部的推力共同作用的結果，由此對絲蛋白液在腺體的不同部位產(chǎn)生相對的剪切速率；在特定的剪切速率下，原本球狀的絲蛋白分子鏈將會取向形成 β-折疊結構。圖 1-3 桑蠶絲腺體和吐絲口的尺寸[52]Fig. 1-3 The mulberry silkworm gland and the size of spinning雖然上述的蠶吐絲機理給出了絲纖維形成的過程，但仍有許多細節(jié)在當時并不明確。比如分子量超過 350000 的蠶絲素蛋白紡絲液在絲腺體中部的濃度 25wt.%，但是其流動性卻很好。后來人們發(fā)現(xiàn)在前部絲腺體中絲素蛋白以液晶態(tài)的形式存在[53,54]。這種方式能有效降低紡絲液在紡絲管中的黏度，從而能夠使絲素蛋白分子在高濃度的紡絲液中完美取向，形成綜合力學性能優(yōu)異的絲纖維。絲素蛋白 GAGAGS 重復片段最初在腺體中的結構為 Silk I[55]。當紡絲液經(jīng)過一段紡絲管時，紡絲管的內(nèi)徑會急劇減小，紡絲液發(fā)生拉伸流動，使絲素蛋白分子鏈構象發(fā)生重排并沿流動方向取向。然后絲素蛋白分子鏈進一步相互靠近并通過疏水作用和氫鍵作用相結合，轉變成 Silk II（β-折疊）結構，水分子逐漸從絲纖維的表面排出。除此之外，pH 值在絲纖維的形成過程中也會發(fā)生變化。在蠶的腺體中，紡絲液沿著紡絲管 pH 值會逐漸下降[31]。研究?

【參考文獻】

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本文編號：2749776