發(fā)布時間：2020-05-22 10:08

【摘要】：組織樣品中的蛋白質(zhì)鑒定一直是生物學研究領域的一項具有挑戰(zhàn)性的課題�；贚C-MS/MS平臺的經(jīng)典蛋白質(zhì)組學雖然可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的深度覆蓋,從而提供全面的數(shù)據(jù)信息,但在樣品制備過程中往往丟失了蛋白質(zhì)分子的空間信息。近年來,蛋白質(zhì)組學對于組織樣品的空間分辨分析提出了更高的要求。雖然質(zhì)譜成像技術解決了空間分辨分析的問題,但由于質(zhì)譜技術的限制,理解質(zhì)譜數(shù)據(jù)背后的生物學意義依舊十分困難。因此,目前迫切需要一種空間分辨的蛋白質(zhì)組學分析方法。在本論文中,我們分別建立了聚丙烯酰胺晶膠原位酶解和L-賴氨酸硅膠棒固定化酶探針兩種原位酶解方法,實現(xiàn)了空間分辨的蛋白質(zhì)組學分析。全文包含以下幾個部分:論文的第一章主要闡述了目前蛋白質(zhì)組學研究中面臨的問題和挑戰(zhàn),對經(jīng)典蛋白質(zhì)工作流中的樣品制備方法進行了綜述,并對現(xiàn)有的空間分辨蛋白質(zhì)組學分析技術進行了總結。提出了本論文的研究目的在于實現(xiàn)空間分辨的蛋白質(zhì)組學分析,并對蛋白質(zhì)進行更深度的覆蓋。論文的第二章中,我們利用聚丙烯酰胺晶膠原位酶解技術,將樣品酶解和采樣結合在一起,實現(xiàn)了空間分辨的蛋白質(zhì)組學采樣和分析。實驗表明,管內(nèi)聚合方式制備的聚丙烯酰胺晶膠尺寸更精準且容易操作。6%的聚丙烯酰胺晶膠孔徑更大,具有更高的傳質(zhì)效率和負載量,在原位酶解蛋白質(zhì)時表現(xiàn)更優(yōu)。聚丙烯酰胺晶膠原位酶解采樣技術的最小采樣尺寸可達92 m,鑒定蛋白質(zhì)數(shù)為450。成功實現(xiàn)了對大鼠皮質(zhì)層和紋狀體的空間分辨蛋白質(zhì)組學分析。論文的第三章中,我們利用L-賴氨酸硅膠棒固定化酶探針進行了空間分辨蛋白質(zhì)組學分析的嘗試。我們利用L-賴氨酸作為單體化合物,3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)和四甲氧基硅烷(TMOS)共同作為溶膠-凝膠反應前體,制備了雜化硅膠整體材料,采用交聯(lián)劑戊二醛在整體材料上共價鍵合胰蛋白酶,獲得雜化硅膠整體固定化酶反應器。實驗表明這種固定化酶反應器通透性較好,交聯(lián)度較高,機械強度較高。固定化酶反應器酶解標準蛋白牛血清白蛋白時得到的序列覆蓋度高達94.4%,這顯示出它對復雜樣品的分析有巨大的潛質(zhì)。這部分工作中,我們成功利用液滴微流控技術制備了 L-賴氨酸硅膠棒,并將其固定到毛細管中,制備了 L-賴氨酸硅膠棒固定化酶探針,但由于硅膠棒孔徑較小、采樣接觸面積較小、且存在較大的采樣位阻,無法實現(xiàn)很好的原位酶解采樣。論文的第四章總結了本論文的研究工作,對不足之處進行了探討,并對為了進一步的研究工作進行了展望。
【圖文】：

0逡逑常見的蛋Ａ質(zhì)組學樣品制備步驟分為：樣品采集、樣品勻漿化、蛋內(nèi)質(zhì)提取、逡逑蛋白質(zhì)酶解，如圖１．２所示。逡逑樣品采集逡逑細胞逡逑—邐樣品勻漿化邐蛋白質(zhì)提取邐蛋白質(zhì)酶解逡逑Ｉ邋—備一巧逡逑體液邐罾逡逑Ｖ邐Ｊ逡逑圖１．２常見的蛋白質(zhì)組學樣品制備步驟逡逑１．２．１樣品采集逡逑常見的蛋白質(zhì)組學樣品分為體液、細胞、微生物和組織，樣品采集一般是粗逡逑放式大質(zhì)量的直接采樣。體液是最容易采集的樣品，通常直接從生物體中抽取，逡逑如血液、腦脊液和唾液等的采集方法；細胞或微生物則需要進行有目的的培養(yǎng)，逡逑在進行樣品處理前需要將細胞或微生物與培養(yǎng)基分離；而組織則根據(jù)Ｉ〗的的不同，逡逑有些實驗需要對整個器官或部分組織進行采集，而有些臨床上的病理學檢查則只逡逑需要進行少量組織穿刺。對于經(jīng)典蛋白質(zhì)組學分析來說，由于蛋白質(zhì)的復雜性和逡逑多樣性，采集的樣品量不能過少，否則后續(xù)分析鑒定將面臨

ＡＶ？＂邋Ｖｔ＊．邐、－逡逑第一章前目體采樣是一個比較特殊的領域，ＳＰＭＥ因其獨特的采樣方式及在此領域得以應用。面向活體的ＳＰＭＥ裝置一般設計為類似樣器（頂空進樣）或是金屬的針狀探針［６５］（用于直接采樣），如是將具有吸附涂層的萃取纖維暴露在樣品中直接進行萃取。經(jīng)后，將ＳＰＭＥ探針直接放到氣相色譜熱脫附或使用溶劑解吸進行分析。隨著近些年檢測儀器分析靈敏度的極大提高，上述分鐘甚至幾秒鐘迅速完成。逡逑
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3

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本文編號：2675835