發(fā)布時(shí)間：2020-03-27 00:49

【摘要】：酶作為一種高效的生物催化劑,具有高效性、強(qiáng)專一性等特點(diǎn),許多難以進(jìn)行的有機(jī)反應(yīng)在酶的催化下都能順利完成。然而,對(duì)于非專一性底物,酶催化往往無(wú)法實(shí)現(xiàn)其高效轉(zhuǎn)化。因此,如何調(diào)控酶結(jié)構(gòu)強(qiáng)化其對(duì)非專一底物的催化轉(zhuǎn)化是近些年來(lái)生物化學(xué)以及催化化學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本論文利用介孔二氧化硅材料構(gòu)筑固定化酶催化劑,利用限域空間內(nèi)固定化酶的界面活性效應(yīng)強(qiáng)化其對(duì)非專一性底物的催化活性。通過(guò)調(diào)控介孔二氧化硅的幾何微環(huán)境(孔道形狀、孔道尺寸)以及化學(xué)微環(huán)境(表面親疏水性),深入研究限域空間內(nèi)固定化酶的界面活化效應(yīng)。主要研究工作如下:1、利用具有二維六方孔道結(jié)構(gòu)的介孔SBA-15以及三維籠狀孔道結(jié)構(gòu)的介孔MCF作為載體,控制孔道尺寸相近的條件下(～11 nm),構(gòu)筑固定化黑曲霉脂肪酶催化劑SBA-15-ANL與MCF-11-ANL,關(guān)聯(lián)限域空間的孔道形狀與反應(yīng)活性。在催化非專一性底物對(duì)氟苯亞甲基丙二腈合成4-H吡喃類藥物的反應(yīng)中,固定化酶SBA-15-ANL(174.6 U g-1)與MCF-11-ANL(246.9 Ug-1)均得到了高于游離酶(64.2 Ug-1)的活性。利用熒光光譜和衰減全反射(ATR)-FTIR研究三級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明不同孔道形狀載體對(duì)酶界面活化作用,界面活化作用依賴于限域效應(yīng),三維籠狀MCF-11可以為酶提供更強(qiáng)的界面活化效應(yīng);2、利用具有三維籠狀孔道結(jié)構(gòu)的介孔SBA-16和MCF作為載體,構(gòu)筑固定化黑曲霉脂肪酶催化劑,調(diào)控限域空間的孔道尺寸(8、11、23、31 nm),關(guān)聯(lián)限域空間的孔道尺寸與反應(yīng)活性,深入研究限域空間內(nèi)固定化酶的界面活化效應(yīng)。在催化非專一性底物對(duì)氟苯亞甲基丙二腈合成4-H吡喃類藥物的反應(yīng)中,反應(yīng)活性隨著孔徑增加存在最優(yōu)值,當(dāng)孔道尺寸為11nm時(shí),MCF-11-ANL催化活性高達(dá)246.9Ug-1。熒光光譜研究表明活性依賴于三維結(jié)構(gòu)Trp微環(huán)境的極性,ATR-FTIR研究表明α-螺旋含量的增加量和β-轉(zhuǎn)角含量的減少量依賴于孔道尺寸,并給出了可能的活性位點(diǎn)氨基酸相對(duì)位置的變化情況以及對(duì)底物在活性中心的結(jié)合方式;3、利用具有三維籠狀介孔二氧化硅MCF表面羥基的可修飾性,分別對(duì)其表面進(jìn)行后接枝修飾不同鏈長(zhǎng)的疏水烷基,構(gòu)筑了不同疏水性質(zhì)的化學(xué)微環(huán)境,用于催化非專一性底物對(duì)氟苯亞甲基丙二腈合成4-H吡喃類藥物的反應(yīng)中,與未改性載體MCF-23(173.3 Ug-1)的活性相比,甲基改性的微環(huán)境MCF-23-CH3-ANL的活性最優(yōu)(233.7 U g-1),但隨著疏水鏈的增長(zhǎng),活性會(huì)有一定程度的降低(121.9、92.2、54.8、33.5 Ug-1),表明隨著疏水性進(jìn)一步增太強(qiáng)活性降低;利用熒光光譜和ATR-FTIR研究三級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明界面活化作用隨著載體表面疏水性增加增強(qiáng),疏水改性更有利于酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的保持;4、進(jìn)一步研究組裝催化劑MCF-23-ANL的重復(fù)使用性能,重復(fù)使用性研究表明使用5次后MCF-23-ANL仍然能保持72%的初始活性;底物普適性研究表明,MCF-23-ANL還可催化對(duì)硝基苯亞甲基丙二腈、對(duì)氯苯亞甲基丙二腈、苯亞甲基丙二腈、對(duì)羥基苯亞甲基丙二腈底物的反應(yīng),對(duì)帶有吸電子取代基的底物具有更好的反應(yīng)活性。
【圖文】：

＝５％）作為溶劑，如表１－１邋（ｅｎｔｒｙ邋４）所示，使用ＰＰＬ水解酶催化２－丁酮和４－硝基苯甲逡逑醛不對(duì)稱加成反應(yīng)，獲得高達(dá)４６．９邋％的產(chǎn)率。逡逑此外，他們對(duì)水解酶催化非專一性底物的機(jī)制進(jìn)行了推斷［２５］。如圖１－３所示，首逡逑先，丙酮首先被Ａｓｐ－Ｈｉｓ殘基組成的二元催化中心和氧陰離子洞穩(wěn)定；隨后，Ｈｉｓ殘逡逑基從丙酮捕獲質(zhì)子并形成一個(gè)烯醇離子，隨后，烯醇離子和另一活化底物醛發(fā)生親核逡逑加成，形成碳－碳鍵，最終產(chǎn)物從氧離子洞釋放出來(lái)。逡逑Ｈｉｓ邐Ｈｉｓ邐Ｈｉｓ逡逑ＨｉＳ＼邐－邐Ｏ邋ＡｓＰ＼邋ｒｉ邋／＝＼邐Ａｓｐｖ邋－逡逑、。力丫邋Ｈ？＇ｈ邋４卜么—卜逡逑Ｏｘｖａｎｉｏｎｈｏｌｃ邋Ｈ邋°＾Ｈ邐／Ｈ邋Ｈ邋Ｈ．邐Ｏｘｖａｎｉｏｎ邋ｈｏｌｅ邋Ｈ邋Ｈ逡逑＇？邋＼邐Ｉ邐Ｉ邋＼逡逑圖１－３脂肪酶催化Ａｌｄｏｌ加成反應(yīng)可能的機(jī)理ｔ２５】逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｐｏｓｓｉｂｌｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋Ａｌｄｏｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｃａｔａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｌｉｐａｓｅ逡逑１．２．１．２邋Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎｓ邋反應(yīng)逡逑Ｍｉｃｈａｅｌ加成的典型代表是親核試劑１．４－共軛加成在ｃｔ，ｐ－不飽和羰基化合物的反逡逑應(yīng)ｔ２６，２＇是通過(guò)１，４－加成形成新Ｃ－Ｃ鍵的最基礎(chǔ)和最有用的方法之一，近幾年來(lái)在合逡逑成中通過(guò)生物蛋白酶催化Ｍｉｃｈａｅｌ加成引起了科學(xué)家門的研究興趣。早在八十年代，逡逑Ｋｉｔａｚｕｍｅ等指出水解酶在緩沖液中具有催化硫醇和胺與不飽和羰基化合物邁克爾逡逑加成的能力，然而，只有在過(guò)去十年，更多關(guān)于酶邁克爾加成的報(bào)道才開(kāi)始出現(xiàn)［２９，３１，逡逑３１］

（３－不飽和醛和酮等，作為受體與１，３－二羰基化合物或環(huán)己嗣反應(yīng)產(chǎn)率高達(dá)逡逑８５邋％。２０１２年，何等Ｗ發(fā)現(xiàn)４－羥基香豆素與ａ，ｐ不飽和烯酮之間的反應(yīng)，用于制備一逡逑種有效的抗凝血?jiǎng)┤A法林及其衍生物，如圖１－４邋ｂ所示，這是第一個(gè)生物催化劑用于逡逑制備華法林及其衍生物的例子。研究表明ＰＰＬ不僅可以催化不對(duì)稱ａｌｄｏ丨反應(yīng)，也可逡逑以催化Ｍｉｃｈａｅｌ加成反應(yīng)。通過(guò)系統(tǒng)地研究ＰＰＬ催化的邁克爾華法林合成參數(shù)的影響逡逑得到中等到產(chǎn)率（高達(dá)９５邋％）和一定對(duì)映選擇性丨ｅｅ值高達(dá)２８邋％）。脂肪酶均被用于逡逑催化邁克爾加成，只有個(gè)別脂肪酶產(chǎn)率高達(dá)９５％，大多數(shù)酶的產(chǎn)率較低，但是依然取逡逑得了很大的成果。逡逑0邋0逡逑Ｑ＾Ｎ0Ｊ邋＋邋Ｘａｏｅ，逡逑ｏ逡逑＾邐Ｎ0邐９邐９邐■邐ＬｔＯ邋－邋ＯＫＩ逡逑２邋＋邋Ｋｔ0＾0Ｅｔ逡逑ｏ邋ｏ逡逑0邋（）邐Ｅｔ（）人邋ｒ邋0Ｅｔ逡逑ｉ邋ｔｏ邋ｆ邋Ｏｕｔ逡逑Ｂｒｉｙ０２邋＋邐＾邋0ｉ＾Ｎ0２逡逑ＯＨ邐ＯＨ邋Ｒ邋Ｏ逡逑ＱＣ＾ＸＨ邋＋邋Ｒ、人邋ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｇ．Ｉ４４，ｈ逡逑圖１－４脂肪酶催化的（ａ）丨，３－二羰基化合物和酮的Ｍｉｃｈａｅ丨加成反應(yīng)及（ｂ）邋４－羥基香豆素與ａ，ｐ不飽逡逑和烯酮的Ｍｉｃｈａｅｌ加成反應(yīng)逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋（ａ）邋Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋１，３－ｄｉｃａｒｂｏｎｙｌ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ邋ａｎｄ邋ｋｅｔｏｎｅ邋ａｎｄ邋（ｂ）逡逑Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ邋ａｎｄ邋ａ
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O643.36;TQ460.4

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本文編號(hào)：2602201