【摘要】：谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶(簡稱GPRAT)是催化嘌呤核苷酸從頭合成第一步的關(guān)鍵酶。GPRAT2是GPRAT的三個同工酶之一。新型乙酸苯三唑類化合物DAS734可以通過抑制GPRAT2的催化反應(yīng)來漂白許多雙子葉雜草,DAS734是特異于AtGPRAT2的抑制劑。通過結(jié)構(gòu)生物學方法研究擬南芥GPRAT2和DAS734的作用機制,對了解化合物調(diào)節(jié)植物的新陳代謝,指導除草劑的合成等具有重要的意義。本篇論文成功構(gòu)建了 pET-22b-AtGPRAT2(75-461)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達蛋白質(zhì),使用親和層析方法純化得到蛋白質(zhì)。通過結(jié)晶實驗,我們最終獲得了 11個可供晶體生長的池液條件,經(jīng)過優(yōu)化沉淀劑、pH、additives,最終在條件HR2-110-11#優(yōu)化基礎(chǔ)上獲得了高質(zhì)量的蛋白晶體,并收集到了 3.1 A的衍射數(shù)據(jù),解析AtGPRAT2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過文獻中的方法,成功制備了 GPRAT2的抑制劑DAS734。為了得到復合物的結(jié)構(gòu),使DAS734結(jié)合到AtGPRAT2的晶體中,采用兩種方法,一種方式是點晶體時加入DAS734,另一種方式是晶體長好后X-射線衍射前,在配制的防凍液中加入DAS734,設(shè)置了泡DAS734的時間和濃度梯度,最后共收到了 24套數(shù)據(jù),但是解析后結(jié)構(gòu)中都沒有DAS734。據(jù)報道隨著DAS734濃度的增加,AtGPRAT2酶活性逐漸降低,而突變體R264K對于DAS734濃度增加,酶的活性沒有影響,因此本實驗對pET-22b-AtGPRAT2進行R264K突變且突變成功,突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌成功進行表達,純化得到了較純的蛋白質(zhì),為酶活性實驗打下基礎(chǔ)。
【圖文】：

同步輻射光源逐漸在蛋白質(zhì)晶體學中發(fā)揮了越來越重要的作用。隨著逡逑重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)、純化的技術(shù)的成熟，，生物大分子的結(jié)構(gòu)解析成為較完善技逡逑術(shù)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學己經(jīng)成為基礎(chǔ)理論和儀器完備的學科。圖１？丨主要表示逡逑了蛋白質(zhì)晶體學的里程碑式成果及技術(shù)發(fā)展，這些發(fā)明和發(fā)展對于蛋白質(zhì)晶體逡逑學至關(guān)重要。逡逑－－邐參”S茫峰澹體義希懾危桑�！邋ｉ辶x希掊�？邋ｎ．邋．Ｕd澹停椋歟澹鄭危懾澹義希危傘殄聞插義希裕澹觶觶澹苠義希玻媯苠澹卞義希誨逖希恚椋㈠義希觶澹危危睿觶鰣澹掊危校剩耍停齲叔義希ｅ義賢跡椋鞍字史矯婢逖Ы獺荊礎(chǔ)垮義希疲椋紓保卞澹裕瑁邋澹洌澹觶澹歟錚穡恚澹睿翦澹錚駑澹穡潁錚簦澹椋鑠澹悖潁螅簦幔歟歟錚紓潁幔穡瑁荊礎(chǔ)垮義希卞義

本文編號：2586892