發(fā)布時(shí)間：2018-07-13 08:30

【摘要】：微小RNA(microRNA,miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源的、長(zhǎng)度約為18～25nt的短鏈非編碼RNA。miRNA具有基因調(diào)控作用,其表達(dá)水平異常往往與疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)。因此,miRNA被視為一類(lèi)新型的生物標(biāo)記物。此外,病毒核酸非編碼區(qū)域含有高度保守性的核酸序列,該保守核酸序列在病毒變異過(guò)程中能夠保持不變。因此,無(wú)論是miRNA,還是病毒核酸保守序列,對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),在相關(guān)疾病的早期診斷和預(yù)測(cè)方面具有重要性意義。金屬有機(jī)骨架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)是由無(wú)機(jī)金屬離子和有機(jī)配體配位自組裝構(gòu)筑形成的新型無(wú)機(jī)有機(jī)雜化材料。2013年,Chen等首次報(bào)道具有良好水穩(wěn)定性的MOFs可與熒光標(biāo)記的探針DNA(probe DNA,P-DNA)結(jié)合構(gòu)筑P-DNA@MOF傳感平臺(tái),用于熒光檢測(cè)核酸分子。但是,MOFs用十核酸分子檢測(cè)仍處在起步階段,只有為數(shù)不多的MOFs被成功用于檢測(cè)DNA/RNA,主要是因?yàn)榇蠖鄶?shù)合成的MOFs對(duì)水不穩(wěn)定。因此,構(gòu)建具有水穩(wěn)定性的MOFs結(jié)構(gòu),并從中篩選出能夠靈敏特異性檢測(cè)疾病相關(guān)的核酸分子對(duì)疾病的檢測(cè)具有重要的意義。近年來(lái),本課題組一直致力于設(shè)計(jì)并合成結(jié)構(gòu)新穎、且具有良好水穩(wěn)定性的MOFs及其生物性能研究。含亞甲基的季銨鹽型多羧酸配體與金屬離子構(gòu)筑的MOFs具有良好水穩(wěn)定性,可避免其在核酸分子檢測(cè)中結(jié)構(gòu)坍塌而導(dǎo)致檢測(cè)失敗。本論文研究了該類(lèi)MOFs與熒光標(biāo)記的探針DNA構(gòu)筑P-DNA@MOF傳感平臺(tái)及其對(duì)疾病相關(guān)的RNA序列檢測(cè)的性能:一、應(yīng)用三維 MOF {[Cu(Cmdcp)(phen)(H20)]2·9H2O}5(1)分別與 FAM 熒光標(biāo)記的P-DNA-1和ROX熒光標(biāo)記的P-DNA-2結(jié)合構(gòu)筑P-DNA-1@1和P-DNA-2@1傳感平臺(tái),并成功用于熒光檢測(cè)EBOV的保守序列片段(T1)及該病毒編碼的類(lèi)miRNA(T2)。其中,MOF 1對(duì)P-DNA-1和P-DNA-2的淬滅率分別為75%和95%;對(duì)Ti和T2的檢測(cè)時(shí)間分別為12.5 min和3.2min,檢測(cè)限分別為63 pM和206 pM。為了克服操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn),進(jìn)一步將P-DNA-1和P-DNA-2同時(shí)與MOF 1結(jié)合構(gòu)筑P-DNAs@1傳感平臺(tái),并結(jié)合恒波長(zhǎng)同步熒光檢測(cè)法同時(shí)對(duì)Ti和T2進(jìn)行熒光檢測(cè)。雖然MOF 1對(duì)T1和T2的同步檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)活性相當(dāng),但是同步檢測(cè)可以簡(jiǎn)稱(chēng)檢測(cè)過(guò)程,節(jié)約檢測(cè)時(shí)間。二、MOFs與P-DNA主要通過(guò)π-π堆積、靜電以及氫鍵等作用力結(jié)合,增加MOFs結(jié)構(gòu)中的π體系有利于MOFs更有效的與P-DNA結(jié)合。因此,我們通過(guò)引入稠環(huán)配體bipy(bipy=4,4'-bipyridine)和具有更大稠環(huán)體系的季銨鹽羧酸 Dcbb(Dcbb= 1-(3,5-dicarboxybenzyl)-4,4'-bipyridiniumbromide)共同構(gòu)建了二維MOF[Cu(dcbb)(bipy)(H2O)]n(2),并將其用于同步熒光檢測(cè)ZIKV非編碼區(qū)的3段保守序列片段T3、T4和T5。研究表明,MOF2對(duì)分別為FAM、ROX和Cy5熒光標(biāo)記的P-DNA-4、P-DNA-5和P-DNA-6均具有良好的熒光淬滅性能,熒光淬滅率分別為88%、96%和80%,并且所構(gòu)筑的P-DNAs@2能夠高靈敏、高選擇性地同步熒光檢測(cè)T3、T4和T5,檢測(cè)時(shí)間分別為12 min、2.3 min和3 min,檢測(cè)限分別為564 pM、158 pM和186 pM。三、為了考察P-DNA@MOF傳感平臺(tái)的實(shí)用價(jià)值,我們將檢測(cè)對(duì)象由病毒核酸非編碼區(qū)的保守序列轉(zhuǎn)為疾病相關(guān)的且表達(dá)異常的miRNA。采用課題組前期合成的一維MOF {[Cu(Dcbb)2(H2O)2]·10H2O}n(3)構(gòu)建傳感平臺(tái),用于熒光檢測(cè)與胃癌相關(guān)的5種miRNA。由于目前仍未尋找到適用于同步熒光檢測(cè)的5 種熒光標(biāo)記物,因此,我們對(duì)與 miR-185(T6)、miR-20a(T7)、miR-92b(T8)、miR-25(T9)以及miR-210(T10)互補(bǔ)的5種DNA均進(jìn)行FAM熒光標(biāo)記,并分別與MOF 3結(jié)合構(gòu)筑P-DNA-6@3～P-DNA-10@3傳感平臺(tái),淬滅率分別為87%、94%、77%、95%以及 96%。P-DNA-6@3～P-DNA-10@3 分別對(duì) T6～T10 逐個(gè)進(jìn)行熒光檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間分別為13 min、14 min、15 min、19 min以及38 min;檢測(cè)限分別為172pM、321pM、91pM、559 pM以及132pM。本實(shí)驗(yàn)研究初步證明以MOFs構(gòu)建的傳感平臺(tái)對(duì)多種miRNA檢測(cè)的可行性。四、為了進(jìn)一步研究MOFs構(gòu)建的傳感平臺(tái)在細(xì)胞水平上對(duì)miRNA的檢測(cè)性能,我們采用了對(duì)核酸酶穩(wěn)定且對(duì)其靶向RNA的親和力較普通核酸強(qiáng)的2'OMe-PSchimera(簡(jiǎn)稱(chēng)mDNA)來(lái)構(gòu)建傳感平臺(tái)。我們采用FAM、TAMRA和Cy5分別對(duì)3種mDNA進(jìn)行熒光標(biāo)記得到P-mDNAs,并與三維的MOF{[Cu2(Cmdcp)2(bipy)(H2O)2]0.5H2O}n(4)同時(shí)結(jié)合構(gòu)筑熒光傳感平臺(tái)P-mDNAs@4用于同步熒光檢測(cè)與口腔癌相關(guān)的miR-21、miR-155和miR-375。其中MOF 4對(duì)P-m21、P-m155和P-m375的熒光淬滅率分別為89%、94%和87%;對(duì)T21、T155和T375的檢測(cè)時(shí)間分別為5.3min、1.9min和1.5min;檢測(cè)限分別為 229pM、64pM 和 385 pM。與 P-DNAs@4 傳感平臺(tái)(對(duì) T21、T155 和 T375 的檢測(cè)時(shí)間分別為13 min、3.4 min和2.6 min;檢測(cè)限分別為750 pM、445 pM和629 pM)相比較,P-mDNAs@4對(duì)靶向miRNA的檢測(cè)更為快速和靈敏。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步將P-mDNA@4導(dǎo)入U(xiǎn)M1、HSC3和SCC9這3種口腔癌細(xì)胞并成功地檢測(cè)胞內(nèi)高表達(dá)的miR-21、miR-155,而對(duì)低表達(dá)的miR-375沒(méi)有顯示檢測(cè)效果。上述熒光檢測(cè)中,MOF 1-4分別構(gòu)筑的熒光傳感平臺(tái)均能快速、靈敏、高選擇性地檢測(cè)相應(yīng)的靶向RNA。我們還進(jìn)一步通過(guò)結(jié)合常數(shù)的計(jì)算、熒光各向異性實(shí)驗(yàn)和PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)初步闡述了 MOFs檢測(cè)核酸分子的檢測(cè)機(jī)理。
[Abstract]:In recent years , MOFs with good water stability have been successfully used to detect DNA / RNA . In recent years , MOFs with good water stability have been successfully used to detect DNA / RNA . In order to further study the feasibility of using MOFs to detect miRNA , the detection limits were respectively 172pM , 321pM , 91pM , 55pM and 132pM . The detection limits were respectively 172pM , 321pM , 91pM , 559 pM and 132pM . The detection limits were respectively : On this basis , we further introduced three kinds of oral cancer cells , such as UM1 , HSC3 and SCC9 , and successfully detected miR - 21 , miR - 155 with high expression of miR - 21 and miR - 155 .
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：O657.3;R440

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本文編號(hào)：2118783