本文選題：核酸檢測(cè) + 熒光��； 參考：《中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：熒光檢測(cè)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品衛(wèi)生、動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫上應(yīng)用廣泛。利用熒光檢測(cè)方法對(duì)核酸進(jìn)行定量分析和特異性識(shí)別在生物醫(yī)學(xué)上具有重要的意義。核酸中的MicroRNA (miRNA)與生命體發(fā)展過(guò)程中多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在調(diào)控時(shí)間順序上,miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控先于蛋白變化,因此,可作為潛在的疾病早期診斷標(biāo)志物。但是,傳統(tǒng)的miRNA檢測(cè)方法大多操作步驟繁瑣,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),需要使用價(jià)格昂貴的檢測(cè)儀器,操作人員需要專門培訓(xùn),檢測(cè)成本高。難以滿足快速、即時(shí)檢測(cè)低豐度miRNA的要求。本研究利用miRNA可對(duì)某些疾病提前表達(dá)的特性,基于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)檢測(cè)miRNA技術(shù),通過(guò)對(duì)特異性miRNA進(jìn)行標(biāo)記,利用光電檢測(cè)方法,根據(jù)標(biāo)志物受激發(fā)出的熒光強(qiáng)度分析得出miRNA的初始濃度。為特異性miRNA快速、即時(shí)檢測(cè)提供一種新技術(shù),利用此技術(shù)開發(fā)的miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)可為冠心病等慢性疾病提供進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層和早期預(yù)警的儀器。研究圍繞熒光快速檢測(cè),具體做了以下幾方面的工作:從熒光產(chǎn)生的機(jī)理出發(fā),通過(guò)理論分析,計(jì)算出采用共焦式熒光檢測(cè)系統(tǒng)和非共焦式熒光檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生的熒光光子數(shù)。分析出若采用共焦結(jié)構(gòu),激發(fā)光光功率1.2mW,則要求光電探測(cè)器最低探測(cè)靈敏度不低于2.77×10-7W;若采用非共焦結(jié)構(gòu),在相同光照強(qiáng)度下,要求光電探測(cè)器最低探測(cè)靈敏度不低于1.98×10-7W。依據(jù)理論計(jì)算結(jié)果選擇非共焦結(jié)構(gòu)中的正入射結(jié)構(gòu)為本研究miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)的光學(xué)結(jié)構(gòu)。根據(jù)miRNA熒光檢測(cè)特點(diǎn),系統(tǒng)設(shè)計(jì)上選擇采用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)對(duì)冠心病特異性miRNA進(jìn)行擴(kuò)增,采用SYBR Green Ⅱ熒光染料作為熒光標(biāo)記物,依據(jù)熒光染料參數(shù)選擇相應(yīng)的光源為發(fā)光二極管(LED),探測(cè)器為光電倍增管(PMT)。根據(jù)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)方式和熒光檢測(cè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),通過(guò)理論計(jì)算,選擇使用半導(dǎo)體加熱作為miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)的加熱方式。通過(guò)對(duì)激發(fā)光光束進(jìn)行光學(xué)整形設(shè)計(jì),使其滿足系統(tǒng)的應(yīng)用要求。對(duì)樣品池進(jìn)行設(shè)計(jì),使其既利于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng),又方便熒光信號(hào)探測(cè),且隔絕了不同樣品之間熒光信號(hào)的串?dāng)_。最后,通過(guò)軟件設(shè)計(jì),完成數(shù)據(jù)處理及人機(jī)交互。通過(guò)設(shè)計(jì)相應(yīng)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),獲得miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)的多項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)。得出miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)熒光強(qiáng)度線性偏倚不超過(guò)±5%、重復(fù)性不低于95%、系統(tǒng)最低檢出限為12個(gè)拷貝等指標(biāo)。使用miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng),對(duì)從心肌細(xì)胞中提取的冠心病標(biāo)志物miR-499進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。從檢測(cè)結(jié)果可以看出,miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以滿足冠心病特異性miRNA實(shí)時(shí)檢測(cè)的目的。實(shí)驗(yàn)得出通過(guò)合理設(shè)置滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)條件,冠心病特異性miRNA檢測(cè)所需時(shí)間低于30分鐘。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度與實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀靈敏度相近,但miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)miRNA所需時(shí)間遠(yuǎn)低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)miRNA所需時(shí)間。這為特異性miRNA快速、即時(shí)檢測(cè)提供了一種有價(jià)值的檢測(cè)技術(shù)。miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)采用正交式檢測(cè)結(jié)構(gòu),通過(guò)整體設(shè)計(jì),降低系統(tǒng)背景光噪聲,提高熒光采集效率,實(shí)現(xiàn)微弱熒光采集,為生物熒光檢測(cè)提供一種小型化設(shè)計(jì)的檢測(cè)方案�；趍iRNA熒光檢測(cè)技術(shù)研發(fā)的miRNA熒光檢測(cè)系統(tǒng)具有成本低、體積小、便于攜帶,操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。不僅可以作為滾環(huán)擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)室專用檢測(cè)設(shè)備,也可以作為中小型醫(yī)療機(jī)構(gòu)日常檢測(cè)的常用設(shè)備,為慢性疾病如冠心病、癌癥等的風(fēng)險(xiǎn)分層、早期預(yù)警和病情追蹤提供一種新型輔助診斷方法。
[Abstract]:In this paper , we use SYBR Green 鈪，

本文編號(hào)：1879774