本文關(guān)鍵詞：基于核酸適配體構(gòu)象變化的抗生素電化學傳感器研究

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【摘要】：抗生素作為一種微生物的代謝產(chǎn)物,具有殺死或抑制微生物生長的作用。近年來作為抗菌藥物被廣泛應用于治療各種非病毒感染疾病,尤其是在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)中的應用越來越廣泛�？股氐倪^量和不正當使用導致了它在食物中的殘留量逐年增加。人們長期食用含有抗生素殘留的食物會導致體內(nèi)抗生素的富集,使人體對抗生素產(chǎn)生抗藥性,同時也誘導產(chǎn)生了超級細菌。近年來食物中抗生素殘留問題受到世界各國的極大關(guān)注,很多國家也制定了一系列有關(guān)食物中抗生素的最大殘留量指標。但是現(xiàn)存檢測抗生素的傳統(tǒng)方法均受到各種內(nèi)在外在條件的限制。因此,迫切需要研究一種高靈敏性、高選擇性的檢測食物中抗生素殘留量的方法。本文利用電化學傳感手段結(jié)合核酸適配體的構(gòu)象變化構(gòu)建了檢測食品中抗生素殘留量的生物傳感器。構(gòu)建的傳感器對待測目標物均表現(xiàn)出較低的檢測限和較寬的線性范圍,并有良好的選擇性和穩(wěn)定性,在實際樣品的檢測中也得到了較好的回收率。本論文主要進行了以下幾方面研究:1.通過在修飾了納米金/石墨烯-殼聚糖復合物的玻碳電極上自組裝巰基化的孔雀石綠適配體來構(gòu)建一個基于電化學傳感體系的RNA適體傳感器來靈敏、特異得檢測孔雀石綠的電化學傳感器。電極構(gòu)建完成后,先將烷硫醇固定在納米金表面來形成統(tǒng)一的修飾,并減少非特異性吸附。然后將修飾好的電極在含有孔雀石綠的體系中孵育,目標物孔雀石綠可以誘導其適配體發(fā)生構(gòu)象變化,并特異性的結(jié)合孔雀石綠,從而將目標分子固定在電極表面。然后再將標記有辣根過氧化物酶的孔雀石綠抗體修飾到電極上,由于抗原抗體之間的特異性識別作用,將辣根過氧化物酶固定在電極表面。最后通過讀取辣根過氧化物酶催化的過氧化氫的電還原信號來實現(xiàn)孔雀石綠的定量檢測。結(jié)果顯示,構(gòu)建的傳感器對孔雀石綠具有較低的檢測限:16.3 pg mL-1和寬的線性范圍:1×10-4-10μg mL-1。因此,基于RNA適配體構(gòu)建的電化學檢測策略能夠簡單、快速、便宜、高靈敏和高特異性的定量檢測孔雀石綠。2.在這項工作中,基于目標物與適配體雜交誘導的二次循環(huán)放大技術(shù),構(gòu)建了一種用于超靈敏和高選擇性的檢測抗生素的簡單、快速、低成本的電化學生物傳感器。巧妙設(shè)計的發(fā)夾探針由目標抗生素的適配體、內(nèi)切酶識別序列和互補雜交序列組成。有檢測目標物存在時,目標物會與發(fā)夾探針上的適配體雜交,誘導發(fā)夾構(gòu)象發(fā)生變化,暴露出來的單鏈末端會捕獲均相中游離的信標探針,以固定的信標探針為引物,發(fā)生鏈延伸反應,生成完全互補的雙鏈結(jié)構(gòu)并把目標物游離出來,循環(huán)利用。生成的雙鏈中含有內(nèi)切酶的識別序列,在內(nèi)切酶與聚合酶的共同作用下,會產(chǎn)生成百上千的單鏈。產(chǎn)生的單鏈可以消耗溶液中的信標探針導致電化學信號降低,從而實現(xiàn)目標物的定量檢測。據(jù)我們所知,這項工作是第一次將基于目標物與適配體雜交誘導的二次循環(huán)放大技術(shù)用于電化學分析檢測抗生素。在最佳條件下,所構(gòu)建的生物傳感器具有超寬的檢測范圍5 pM-10nM和極低的檢測限1.09 pM。此外,本研究的生物傳感器也顯示對目標物氨芐青霉素具有高選擇性,并具有檢測速度快、成本低,操作簡單等優(yōu)點。因此,基于目標物與適配體雜交誘導的二次循環(huán)放大技術(shù)用于檢測氨芐青霉素的電化學方法具有用于實際中相關(guān)食品安全分析和臨床診斷的潛力。3.基于多重循環(huán)放大技術(shù)構(gòu)建了一種超靈敏檢測抗生素的電化學DNA傳感器。該多重循環(huán)放大包括聚合酶輔助的目標物循環(huán)放大和核酸外切酶輔助的二級目標物循環(huán)放大。在實驗過程中,巧妙設(shè)計的發(fā)夾探針會被目標物與適配體之間的特異性雜交打開,并引發(fā)聚合酶誘導的目標物循環(huán)放大反應,產(chǎn)生成千上萬的二級目標物。值得注意的是,產(chǎn)生的二級目標物不僅能夠與剩下的發(fā)夾探針發(fā)生反應,也能置換下電極上的輔助探針。使亞甲基藍標記的發(fā)夾探針自身折疊形成穩(wěn)定的發(fā)夾構(gòu)象,并獲得較高的電化學還原峰。經(jīng)過多重的信號放大技術(shù)構(gòu)建的傳感器可以超靈敏的檢測目標抗生素,其最低檢測限可達1.3 fM。據(jù)我們所知,這項工作首次將多重循環(huán)放大與正信號的傳感策略結(jié)合用來定量檢測抗生素。該策略也可進一步結(jié)合更多的分析手段來檢測更多的目標物,所以該傳感手段具有構(gòu)建超靈敏的生物傳感平臺進行生物分析,疾病診斷和臨床藥物的潛力。
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O657.1;TP212

【參考文獻】

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本文編號：1303036