本文關(guān)鍵詞：茶樹咖啡堿生物合成關(guān)鍵酶基因的原核表達及功能驗證

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【摘要】：咖啡堿是一種黃嘌呤生物堿化合物,作為常見的嘌呤堿,被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于多種植物種中。人類最常食用的含咖啡堿的植物包括咖啡、茶、可可�？Х葔A不僅是茶葉重要的滋味物質(zhì),而且是茶葉生物堿的主要組分。盡管咖啡堿對一些特殊人群造成一定負面影響,如孕婦出現(xiàn)自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、低體重兒,但是適量的咖啡堿對人體有很多積極作用,如提神醒腦、利尿護肝、促進消化等。全球生產(chǎn)的咖啡堿除一部分應(yīng)用于工業(yè)外,大部分被用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。化學(xué)合成的咖啡堿不僅有毒副作用,而且合成過程中一些物質(zhì)污染環(huán)境,天然提取仍存在設(shè)備昂貴、有毒物質(zhì)殘留等問題。生物合成咖啡堿具有無污染、無毒副作用等優(yōu)點。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)基本掌握茶樹中咖啡堿生物合成主要途徑和供體途徑,也為生物合成咖啡堿奠定了基礎(chǔ)。具體合成途徑是:腺嘌呤核苷酸(AMP)→次黃嘌呤核苷酸(IMP)→黃嘌呤核苷酸(XMP)→黃嘌呤核苷(XR)→7-甲基黃嘌呤核苷(7-MXR)→7-甲基黃嘌呤(7-MX)→可可堿(Tb)→咖啡堿(Cf)。通過分析比對蛋白質(zhì)空間模型,將咖啡堿合成酶(TCS1)進行定點突變,突變體TMX突變位置與TCS1相比,分別為:TM1(673CGT→CAT);TM2(949GTT→ATG);TM3(811TTT→TGG);TM4(814GCA→CCA)�？Х葔A合成酶突變體TMX的單獨表達中,體外活性檢測結(jié)果顯示:TM1只能催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿,TM2/3/4均能催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿和咖啡堿,但是咖啡堿含量較低(該部分工作由茶葉重點實驗室完成)。本研究在TCS1突變體單獨表達基礎(chǔ)上,構(gòu)建了四個突變體TMX和咖啡黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶(CaXMT)的共表達載體,嘗試通過大腸桿菌進行體外合成咖啡堿,并試圖尋找合成咖啡堿的廉價底物。論文主要取得以下結(jié)果:(1)將CaXMT和TMX串聯(lián)到同一表達載體pMAL-c5X上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞中進行共表達,制備粗酶液并添加底物XR和SAM,體外酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測。結(jié)果顯示,pMAL-CaXMT-TM2/3/4的酶反應(yīng)產(chǎn)物有可可堿生成,但是均未檢測到咖啡堿生成。pMAL-CaXMT-TM1的酶反應(yīng)產(chǎn)物只有7-MX。(2)表達載體pRSF-Duet1具有雙啟動子,將CaXMT和TMX先后連接到兩個啟動子下,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞中進行共表達。體外酶反應(yīng)檢測結(jié)果顯示,pRSF-CaXMT-TM1的酶反應(yīng)產(chǎn)物為可可堿,pRSF-CaXMT-TM2/3/4的酶反應(yīng)產(chǎn)物均有咖啡堿生成,且pRSF-CaXMT-TM4的咖啡堿生成量最大,為1.89μg/mL。(3)在茶樹嫩葉中克隆次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(TIDH),驗證了該酶具有催化次黃嘌呤核苷酸反應(yīng)生成黃嘌呤核苷酸的活性。本研究均是在大腸桿菌中進行的,其中CaXMT和TMX在pRSF-Duet1中成功進行共表達,可以實現(xiàn)體外合成咖啡堿。TIDH可通過輔酶I(NAD+)催化次黃嘌呤核苷酸生成黃嘌呤核苷酸,即黃嘌呤核苷的前體物質(zhì)。本研究不僅為構(gòu)建生物合成咖啡堿的共表達載體奠定了基礎(chǔ),而且為探索咖啡堿生物合成中廉價底物提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O629.3

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