本文關(guān)鍵詞：均相電化學(xué)及熒光生物傳感新方法在癌癥標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用研究

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【摘要】：癌癥是威脅人類生命的主要疾病之一,在臨床醫(yī)學(xué)中大部分癌癥到晚期才能確診,如果能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷,可以有效控制病情,降低死亡率。近年來,癌癥標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)為癌癥的早期診斷提供了可能,針對(duì)癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)已成為分析化學(xué)領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。均相DNA生物傳感器具有簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于基因分析、疾病診斷等領(lǐng)域。本論文利用核酸分子構(gòu)建了均相DNA生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了癌癥標(biāo)志物的高靈敏檢測(cè)。系統(tǒng)介紹了DNA生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)和檢測(cè)原理,并重點(diǎn)介紹了電化學(xué)和光學(xué)DNA生物傳感器。進(jìn)一步概述了核酸擴(kuò)增技術(shù),并對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、端粒酶和microRNA進(jìn)行了介紹�；诩谆l(fā)的核酸外切酶Ⅲ輔助等溫自發(fā)循環(huán)信號(hào)放大策略,構(gòu)建均相電化學(xué)生物傳感平臺(tái),實(shí)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的便捷、高靈敏檢測(cè)。在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下,雙鏈DNA發(fā)生甲基化過程,被Dpn I識(shí)別并切割,釋放出單鏈DNA,在核酸外切酶Ⅲ輔助下引發(fā)循環(huán)切割過程,釋放出大量亞甲基藍(lán)(MB)標(biāo)記的短鏈DNA,擴(kuò)散到電極表面,實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)的放大。該策略實(shí)現(xiàn)了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的超靈敏檢測(cè),檢測(cè)限可達(dá)0.004 U/mL,比文獻(xiàn)報(bào)道低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。基于核酸外切酶T7輔助循環(huán)信號(hào)放大策略,首次建立了單細(xì)胞水平端粒酶活性均相電化學(xué)檢測(cè)新方法。當(dāng)端粒酶存在時(shí),5'端標(biāo)記MB的發(fā)卡探針與延伸序列雜交,觸發(fā)核酸外切酶T7輔助的循環(huán)放大過程,釋放出大量亞甲基藍(lán)(MB)標(biāo)記的短鏈DNA,擴(kuò)散到電極表面,實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)的放大。該項(xiàng)研究可檢測(cè)到單個(gè)HeLa細(xì)胞中的端粒酶活性,實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平端粒酶活性的均相電化學(xué)檢測(cè)�；谀繕�(biāo)物觸發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR),首次構(gòu)建了免酶、免標(biāo)記均相電化學(xué)生物傳感平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了高靈敏miRNA電化學(xué)檢測(cè)。目標(biāo)miRNA可以觸發(fā)兩個(gè)亞穩(wěn)態(tài)發(fā)夾間的HCR,形成含有多個(gè)G四聯(lián)體的雙螺旋DNA長(zhǎng)鏈,MB嵌插入G四聯(lián)體及DNA雙鏈后,其擴(kuò)散到電極表面的能力明顯減弱,導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)減小,從而實(shí)現(xiàn)了“關(guān)信號(hào)”miRNA均相電化學(xué)檢測(cè)。該方法免酶、免標(biāo)記,具有靈敏度高、選擇性好、簡(jiǎn)單、便捷、成本低等突出優(yōu)點(diǎn)�；诘葴刂笖�(shù)放大策略,利用氧化石墨烯吸附單鏈核酸并保護(hù)miRNA免受酶水解的性質(zhì),建立了免標(biāo)記熒光檢測(cè)miRNA的新方法。發(fā)夾DNA與目標(biāo)miRNA雜交,引發(fā)DNA聚合與鏈置換反應(yīng),實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)過程。形成的雙鏈DNA被內(nèi)切酶識(shí)別并切割,產(chǎn)生與目標(biāo)miRNA具有相同序列的觸發(fā)DNA,引發(fā)新的鏈增長(zhǎng)過程,從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)miRNA的循環(huán)等溫指數(shù)放大。SG嵌插入形成的雙鏈DNA后,熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。由于采用了免標(biāo)記策略,避免了昂貴且繁瑣的標(biāo)記過程,該方法還具有簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.1

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