本文關(guān)鍵詞：基于文庫固定化的瘦肉精適配子篩選及應(yīng)用研究

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【摘要】：鹽酸克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺三種瘦肉精是目前畜牧養(yǎng)殖中最為常見的非法添加物,位列我國動物藥品禁用目錄之首。近年來,由于非法添加瘦肉精而引起突發(fā)中毒事件頻發(fā),給社會穩(wěn)定和人類健康帶來嚴(yán)重危害。因此構(gòu)建快速、靈敏的分析方法應(yīng)用于鹽酸克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺的現(xiàn)場檢測具有重大意義。本研究通過采用文庫固定化SELEX技術(shù)同時篩選制備鹽酸克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺三種瘦肉精的適配子。文庫固定化篩選成本低,操作簡單,同時消除了固定靶標(biāo)空間位阻的影響,能夠?qū)崿F(xiàn)多個靶標(biāo)適配子的同時篩選。通過該方法篩選的三種瘦肉精的適配子可作為新型的識別探針應(yīng)用于現(xiàn)場檢測中。主要篩選應(yīng)用過程如下:首先,基于文庫固定化SELEX篩選鹽酸克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺的適配子。設(shè)計一段與文庫引物區(qū)互補配對的生物素化互補鏈P1(Biotin-P1),并與單鏈DNA(ss DNA)文庫雜交互補,再將ss DNA文庫通過Biotin-P1固定在親和素包被的磁珠上。固定化文庫與靶標(biāo)鹽酸克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺孵育,固定的ss DNA結(jié)合靶標(biāo)時構(gòu)象發(fā)生改變,導(dǎo)致ss DNA與Biotin-P1分離并磁珠上脫落至溶液中,再通過磁分離獲得結(jié)合靶標(biāo)的ss DNA。經(jīng)過反復(fù)的文庫固定,孵育,分離,洗脫,PCR,酶切和純化,在16輪正篩和7次反篩后富集了與鹽酸克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺特異性結(jié)合的適配子。其次,適配子親和性和特異性驗證�？寺y序后,針對三種靶標(biāo)各獲得40條序列。通過分析序列的同源性和二級結(jié)構(gòu)挑選鹽酸克倫特羅候選適配子序列8條,沙丁胺醇候選適配子序列10條和萊克多巴胺候選適配子序列9條進行FAM標(biāo)記合成用于驗證。經(jīng)過驗證后獲得一條能同時識別鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的適配子Apt-3序列,結(jié)合解離常數(shù)(Kd)分別為38.45±7.01 nmol/L和47.00±6.42 nmol/L,一條能特異性識別鹽酸克倫特羅的適配子CLB-2,Kd值為76.61±12.70 nmol/L,一條能特異性識別沙丁胺醇的適配子SAL-5,Kd值為53.60±11.81 nmol/L和一條能夠特異性識別萊克多巴胺的適配子RAC-6,Kd值為54.22±8.02 nmol/L。最后,構(gòu)建基于適配子識別鹽酸克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺的熒光分析法。基于適配子CLB-2特異性識別鹽酸克倫特羅,在濃度0.10-50.00 ng/m L范圍內(nèi)相對熒光強度與鹽酸克倫特羅濃度間線性良好(R2=0.9905),檢測限為0.08 ng/m L。基于適配子SAL-5特異性識別檢測沙丁胺醇,在0.50-100.00 ng/m L范圍內(nèi)相對熒光強度與沙丁胺醇濃度間線性良好(R2=0.9966),檢測限為0.12 ng/m L。基于適配子RAC-6特異性識別萊克多巴胺,在0.10-100.00 ng/m L范圍內(nèi)相對熒光強度與萊克多巴胺濃度間線性良好(R2=0.9925),檢測限為0.04 ng/m L。同時該方法可用于實際豬肉樣品的檢測,回收率范圍為84.50%-110.50%。
【關(guān)鍵詞】：鹽酸克倫特羅 沙丁胺醇 萊克多巴胺 適配子 SELEX
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3;TS207
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 1 前言7-17
• 1.1 瘦肉精概述7
• 1.2 瘦肉精檢測方法7-10
• 1.2.1 色譜分析法8
• 1.2.2 免疫學(xué)方法8-10
• 1.3 適配子10-12
• 1.3.1 適配子概述10
• 1.3.2 適配子應(yīng)用10-12
• 1.4 SELEX篩選技術(shù)12-16
• 1.4.1 SELEX技術(shù)概述12-13
• 1.4.2 基于固定靶標(biāo)的SELEX技術(shù)13
• 1.4.3 基于游離靶標(biāo)的SELEX技術(shù)13-16
• 1.5 本課題的立題意義及研究內(nèi)容16-17
• 2 實驗材料與方法17-24
• 2.1 主要試劑17
• 2.2 主要儀器17
• 2.3 隨機ssDNA文庫和引物的構(gòu)建17-18
• 2.4 Fe_3O_4磁性納米顆粒制備與修飾18
• 2.4.1 氨基化Fe_3O_4磁性納米顆粒制備與表征18
• 2.4.2 親和素包被氨基化磁珠18
• 2.5 體外篩選三種瘦肉精的適配子18-21
• 2.5.1 文庫固定化SELEX篩選流程18-19
• 2.5.2 文庫固定與孵育19
• 2.5.3 PCR擴增19-20
• 2.5.4 單鏈的制備和純化20
• 2.5.5 循環(huán)篩選20-21
• 2.5.6 克隆測序及序列分析21
• 2.6 適配子親和性和特異性驗證21-23
• 2.6.1 親和性和特異性驗證原理21-22
• 2.6.2 氧化石墨烯吸附條件優(yōu)化22
• 2.6.3 適配子親和性驗證22
• 2.6.4 適配子特異性驗證22-23
• 2.7 熒光分析法檢測瘦肉精23-24
• 3 結(jié)果與討論24-42
• 3.1 氨基化磁珠合成及修飾24-25
• 3.1.1 氨基化磁珠表征24
• 3.1.2 親和素包被磁珠24-25
• 3.2 三種瘦肉精的適配子篩選25-28
• 3.2.1 ssDNA文庫固定25
• 3.2.2 PCR退火溫度的優(yōu)化25-26
• 3.2.3 PCR擴增26-28
• 3.3 適配子序列分析28-30
• 3.3.1 鹽酸克倫特羅適配子序列分析28-29
• 3.3.2 沙丁胺醇適配子序列分析29-30
• 3.3.3 萊克多巴胺適配子序列分析30
• 3.4 適配子親和性驗證30-35
• 3.4.1 氧化石墨烯用量優(yōu)化30-31
• 3.4.2 氧化石墨烯吸附靶標(biāo)驗證31-32
• 3.4.3 鹽酸克倫特羅適配子親和性驗證32-33
• 3.4.4 沙丁胺醇適配子親和性驗證33-34
• 3.4.5 萊克多巴胺適配子親和性驗證34-35
• 3.5 適配子特異性驗證35-37
• 3.5.1 鹽酸克倫特羅適配子特異性驗證35-36
• 3.5.2 沙丁胺醇適配子特異性驗證36-37
• 3.5.3 萊克多巴胺適配子特異性驗證37
• 3.6 適配子結(jié)構(gòu)分析37-38
• 3.7 基于適配子識別的熒光分析檢測38-42
• 3.7.1 熒光分析法檢測鹽酸克倫特羅38-39
• 3.7.2 熒光分析法檢測沙丁胺醇39-40
• 3.7.3 熒光分析法檢測萊克多巴胺40-42
• 主要結(jié)論與展望42-44
• 主要結(jié)論42
• 展望42-44
• 致謝44-45
• 參考文獻45-52
• 附錄一：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文52-53
• 附錄二：序列表53-58

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本文編號：1010352