本文關(guān)鍵詞：白淺灰鏈霉菌對(duì)聚乙烯降解效果研究及降解酶的基因克隆

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【摘要】：近幾年工業(yè)的迅速發(fā)展帶來了嚴(yán)重的“白色污染”問題,影響著我們的生產(chǎn)與生活,在眾多緩解“白色污染”、處理廢棄塑料的方法中,利用微生物降解塑料成為熱門研究領(lǐng)域之一。本試驗(yàn)首先從土壤中篩選、分離出一株能夠降解聚乙烯的放線菌,通過進(jìn)行菌落形狀、大小、顏色等形態(tài)學(xué)的觀察、生理生化鑒定和16S r DNA的全序列克隆測序,鑒定其為Streptomyces albogriseolus白淺灰鏈霉菌。其次初探白淺灰鏈霉菌對(duì)聚乙烯的降解效果研究:(1)對(duì)相對(duì)分子量分別為2000、5000、10W和40W的聚乙烯粉末進(jìn)行研究,結(jié)果表明不同分子量的聚乙烯粉末都可以被白淺灰鏈霉菌降解,且降解程度從大到小依次為:2000500010W40W;(2)對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量100W的聚乙烯膜片進(jìn)行研究,結(jié)果表明白淺灰鏈霉菌附著在聚乙烯膜片上進(jìn)行生長且在肉眼和掃描電子顯微鏡下觀察均發(fā)現(xiàn)膜片表面有破損和孔洞,由此說明聚乙烯膜片也可以被白淺灰鏈霉菌所降解。所以可知白淺灰鏈霉菌不僅屬于低分子量聚乙烯降解菌,也屬于高分子量甚至超高分子量降解菌。再次探究白淺灰鏈霉菌降解聚乙烯的關(guān)鍵酶:先用漆酶和HBT(1-羥基苯并三唑)構(gòu)建了一個(gè)中間體或介導(dǎo)體,在30℃的環(huán)境中降解相對(duì)分子質(zhì)量為2000的聚乙烯粉末,在3 d以后可以看到實(shí)驗(yàn)組的聚乙烯粉末顆粒變小,溶液呈淺黃色。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明漆酶是降解聚乙烯的關(guān)鍵酶。利用ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)法檢測白淺灰鏈霉菌發(fā)酵液中含有漆酶蛋白且測定其酶活。比較NCBI gene數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的鏈霉菌漆酶基因序列,設(shè)計(jì)引物K-F2、K-R2,利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增出白淺灰鏈霉菌基因組DNA中的漆酶基因,進(jìn)行BLAST比對(duì)與分析。將得到的漆酶基因與克隆質(zhì)粒p EASY-T1 Cloning Vector連接,構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒p EASY-T1 Cloning Vector/laccase,導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中并進(jìn)行陽性克隆驗(yàn)證。采用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和Bam HⅠ對(duì)重組克隆質(zhì)粒p EASY-T1 Cloning Vector/laccase與原核表達(dá)載體p ET-32a-c(+)Vector進(jìn)行雙酶切,露出粘性末端,采用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接,導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞中BL21(DE3)Chemically Competent Cell中并進(jìn)行陽性克隆驗(yàn)證。最后,將攜帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行檢測:(1)將其接種在聚乙烯為唯一碳源和能源的基礎(chǔ)無碳源固體培養(yǎng)基上進(jìn)行生長,結(jié)果顯示有菌落長出,說明大腸桿菌BL21(DE3)可以利用聚乙烯粉末;(2)將攜帶p ET-32a-c(+)Vector/laccase的大腸桿菌BL21(DE3)的發(fā)酵液用硫酸銨分級(jí)沉淀制成粗酶液,用SDS-PAGE檢測到粗酶液中含有漆酶蛋白且分子量大小約為66.4 KDa。通過一系列的基因克隆技術(shù),將白淺灰鏈霉菌中的漆酶基因?qū)氲酱竽c桿菌中并表達(dá)成功。說明漆酶是降解聚乙烯的關(guān)鍵酶,這將為以后探索微生物對(duì)聚乙烯降解機(jī)制、篩選漆酶高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：基因克隆 聚乙烯粉末 漆酶基因 白淺灰鏈霉菌 基因組DNA
【學(xué)位授予單位】：四川師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;X172
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-18
• 1.1 課題背景10-11
• 1.1.1 課題來源10
• 1.1.2 課題的目的和意義10
• 1.1.3 課題的研究內(nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn)10-11
• 1.2 聚乙烯降解的研究概況11-14
• 1.2.1 聚乙烯的定義與分類11-12
• 1.2.2 聚乙烯研究背景12-13
• 1.2.3 目前所用降解菌的種類13
• 1.2.4 聚乙烯生物降解國內(nèi)外研究情況對(duì)比13-14
• 1.2.5 發(fā)展前景及方向14
• 1.3 漆酶的研究概況14-18
• 1.3.1 漆酶的分布14-15
• 1.3.2 漆酶的理化性質(zhì)15-16
• 1.3.3 漆酶的應(yīng)用16-18
• 2 白淺灰鏈霉菌對(duì)聚乙烯的降解效果研究18-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 2.1.2 培養(yǎng)基19
• 2.1.3 藥品及試劑19-20
• 2.1.4 菌種20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-23
• 2.2.1 聚乙烯降解菌株篩選方法20-22
• 2.2.2 菌株F1對(duì)聚乙烯降解能力的初探22-23
• 2.3 結(jié)果與討論23-31
• 2.3.1 菌株F1的篩選與分離23
• 2.3.2 菌株F1的鑒定23-29
• 2.3.3 菌株F1對(duì)聚乙烯降解能力的初探29-31
• 2.4 結(jié)論31-33
• 3 白淺灰鏈霉菌漆酶基因的克隆33-67
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料33-38
• 3.1.1 菌種與載體33-34
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑34-36
• 3.1.3 培養(yǎng)基36
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器36-37
• 3.1.5 引物37-38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法38-48
• 3.2.1 漆酶降解聚乙烯粉末38
• 3.2.2 白淺灰鏈霉菌發(fā)酵液中漆酶的檢測及其活性的測定38
• 3.2.3 漆酶基因的克隆38-45
• 3.2.4 攜帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)中漆酶的檢測45-48
• 3.3 結(jié)果與討論48-66
• 3.3.1 漆酶降解聚乙烯粉末48-49
• 3.3.2 白淺灰鏈霉菌發(fā)酵液中漆酶的檢測及其活性的測定49-51
• 3.3.3 漆酶基因的克隆51-62
• 3.3.4 攜帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)中漆酶的檢測62-66
• 3.4 結(jié)論66-67
• 總結(jié)與展望67-69
• 參考文獻(xiàn)69-86
• 附錄86-89
• 致謝89

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 古靜燕,劉紅兵,崔承彬,顧謙群;海洋來源白淺灰鏈霉菌中環(huán)二肽類化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J];中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年04期

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3 盧文s，

本文編號(hào)：593892