金屬鉛由于其特殊的物理化學性質在工業(yè)上被廣泛使用,隨后沉積在環(huán)境中。但是,對于生物體來說,鉛并不是機體所需要的元素,反而會機體帶來很大危害,能夠引起神經、血液、胃腸道、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的毒性。不過,鉛消化毒性機理研究還不多見。在本課題組首次發(fā)現(xiàn)高濃度鉛抑制斑馬魚(Danio rerio)胰蛋白酶原基因ela2L表達的基礎上,本研究利用0.1、0.2和0.3g/L的Pb(NO3)2處理斑馬魚胚胎,real-timePCR和胚胎整體原位雜交結果均顯示,鉛處理均使斑馬魚胰蛋白酶原基因的表達下調。鄰聯(lián)茴香胺染色實驗表明0.2g/L Pb(NO3)2使斑馬魚胚胎中血紅素水平降低,RT-PCR和real-time PCR實驗證實這個降低具有雙重性,0.2g/LPb(NO3)2一方面使血紅素合成過程中部分酶的基因表達水平降低,另一方面使控制血紅素降解的ho-1表達升高,既抑制了血紅素的合成又促進其降解。最近,已有研究證實血紅素對斑馬魚胰蛋白酶原基因的調節(jié)是通過Bach1b/Nrf2a-MafK路徑實現(xiàn)的。由此,我們有理由相信,鉛可使血紅素水平降低,再通過血紅素-Bach/Nrf-Maf...

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 重金屬鉛對生物體的影響
    1.2 鉛對血紅素的影響
    1.3 血紅素的生物合成和降解
        1.3.1 血紅素合成
        1.3.2 血紅素降解
    1.4 血紅素的生理學功能
    1.5 血紅素調控路徑
        1.5.1 CNC家族
        1.5.2 血紅素-Bach/Nrf-Maf路徑
        1.5.3 Bach/Nrf-Maf路徑組分簡介
        1.5.4 全基因組倍增
    1.6 血紅素、Bach/Nrf-Maf路徑和胰蛋白酶原基因
    1.7 模式生物斑馬魚
    1.8 本研究的目的及意義
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 斑馬魚的來源和飼養(yǎng)
        2.1.2 ZF4細胞的來源和培養(yǎng)
    2.2 工具酶、載體和試劑盒
    2.3 主要的生化試劑
    2.4 主要實驗藥品的配制
    2.5 引物列表
    2.6 主要儀器設備
    2.7 實驗方法
        2.7.1 實驗材料的獲得
        2.7.2 斑馬魚總RNA與ZF4細胞RNA樣品的獲取
        2.7.3 目的基因擴增
        2.7.4 目的DNA片段回收
        2.7.5 目的DNA片段連接到載體上
        2.7.6 連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞以及陽性檢測
        2.7.7 斑馬魚胚胎整體原位雜交
        2.7.8 σ-dianisidine(鄰聯(lián)茴香胺)染色
        2.7.9 RT-PCR
        2.7.10 Real-time RCR
        2.7.11 MTT法檢測細胞存活率
3 實驗結果和分析
    3.1 斑馬魚bach基因的克隆與同源性分析
        3.1.1 斑馬魚bach基因的克隆
        3.1.2 斑馬魚Bach蛋白同源性分析
        3.1.3 斑馬魚Bach蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化分析
    3.2 斑馬魚bach基因時空表達研究
        3.2.1 RT-PCR研究斑馬魚bach基因發(fā)育各時期的表達情況
        3.2.2 胚胎整體原位雜交技術研究斑馬魚bach基因的時空表達情況
    3.3 bach基因對鉛毒性的應答差異
    3.4 斑馬魚nrf1a和nrf2b基因的時空表達情況
        3.4.1 探針的合成
        3.4.2 胚胎整體原位雜交
    3.5 鉛抑制胰蛋白酶原基因表達的分子路徑
        3.5.1 胚胎整體原位雜交檢測不同濃度鉛處理對胰蛋白酶原基因表達的影響
        3.5.2 Real-time PCR檢測不同濃度鉛處理對胰蛋白酶原基因表達的影響
    3.6 鉛對血紅素生物合成與降解的影響
        3.6.1 血紅素染色實驗
        3.6.2 鉛處理對血紅素合成酶基因的影響
        3.6.3 鉛處理對血紅素降解相關基因的影響
    3.7 血紅素調節(jié)胰蛋白酶原基因表達的分子路徑初探
    3.8 鉛是否通過Bach/Nrf調控途徑抑制胰蛋白酶原基因的表達
        3.8.1 鉛處理斑馬魚胚胎對Bach/Nrf-Maf調控途徑相關基因的影響
        3.8.2 羥基酪醇對斑馬魚ZF4細胞胰蛋白酶原基因的影響
4 討論與展望
    4.1 斑馬魚bach基因的克隆、序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析
    4.2 bach基因表達模式研究
    4.3 鉛抑制胰蛋白酶原基因表達的分子路徑
        4.3.1 鉛通過調控血紅素生物合成酶的轉錄來抑制血紅素合成
        4.3.2 血紅素調節(jié)的Bach/Nrf-Maf路徑調節(jié)胰蛋白酶原基因表達
        4.3.3 鉛直接通過Bach/Nrf-Maf路徑調節(jié)胰蛋白酶原基因表達
    4.4 展望
參考文獻
研究生期間學術論文已發(fā)表及待發(fā)表情況
致謝



本文編號：3783953