砷污染已成為一個(gè)全球性問題。尋找行之有效的砷污染治理與修復(fù)方法一直是人們努力追求的目標(biāo)與方向。微生物砷甲基化能將高毒無機(jī)As(III)轉(zhuǎn)化為低毒和高揮發(fā)性甲基胂,被認(rèn)為是一種環(huán)境砷污染修復(fù)的有效手段。然而,大多數(shù)微生物的砷揮發(fā)效率相對(duì)有限,難以達(dá)到應(yīng)用目的。分析其原因,可能是微生物產(chǎn)生的砷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降低了胞內(nèi)砷含量,競(jìng)爭(zhēng)性地限制了微生物的砷揮發(fā)效率,究竟是否如此,目前尚不明確。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009是研究砷代謝機(jī)制的模式生物,但其砷揮發(fā)效率很低,基因組顯示有2個(gè)砷外排基因,其表達(dá)蛋白將砷排出胞外可能是限制微生物砷甲基化反應(yīng)的主要原因。為了證明這一假設(shè),本研究首先建立了響應(yīng)胞內(nèi)砷濃度的生物傳感器,旨在通過監(jiān)測(cè)胞內(nèi)砷含量的高低,比較了不同來源砷外排蛋白的活性及其對(duì)砷甲基化的影響;進(jìn)一步通過敲除CGA009菌株2個(gè)砷外排基因,研究了砷外排蛋白對(duì)砷甲基化的影響。主要研究結(jié)果如下:(1)插件式生物傳感器建立和砷外排蛋白活性的比較。以Escherichia coli BL21(DE3)的砷抗性操縱子(Pars、arsR、arsB和arsC)為基礎(chǔ),以綠色熒光蛋白基因(gfp)為報(bào)告基因,砷敏感菌株E.coli AW3110(DE3)(?arsRBC)為宿主,構(gòu)建了響應(yīng)胞內(nèi)砷濃度的插件式砷生物傳感器系統(tǒng)(B系統(tǒng))。以E.coli BL21(DE3)的ArsB_(EC)為對(duì)照,比較了源于CGA009的2種砷外排蛋白(ArsBRP/Acr3RP)的外排活性。結(jié)果表明:熒光強(qiáng)度與As(III)濃度(0~2.0μmol/L)呈良好的線性關(guān)系,As(III)濃度升高,GFP熒光強(qiáng)度升高;砷外排蛋白活性越高,細(xì)胞內(nèi)砷含量則越低,則熒光強(qiáng)度也越低;這3種砷外排蛋白的活性順序?yàn)锳rsB_(RP)ArsB_(EC)Acr3_(RP),與砷抗性實(shí)驗(yàn)測(cè)定的活性順序一致。本研究提供了一種比較砷外排蛋白活性的方法,與經(jīng)典抗性測(cè)定的方法相比,該方法線性關(guān)系更好、靈敏度更高、砷用量少,操作更安全。(2)砷外排蛋白對(duì)微生物砷甲基化的限制作用。將源于CGA009的砷甲基化酶基因(arsM)與B系統(tǒng)中不同砷外排基因元件共表達(dá),構(gòu)建砷生物傳感器系統(tǒng)(BM系統(tǒng)),通過As(III)抗性測(cè)定、熒光檢測(cè)、HPLC-ICP-MS砷形態(tài)分析和總砷含量測(cè)定,研究不同砷外排蛋白對(duì)微生物砷甲基化的影響。結(jié)果表明:砷外排蛋白活性越高,微生物砷抗性越高,GFP熒光強(qiáng)度越低,微生物砷甲基化和砷揮發(fā)效率越低;在100.0μmol/L As(III)孵育12 h時(shí),與無砷外排基因的重組菌的砷揮發(fā)能力(10.01%)相比,arsB_(RP)、arsB_(EC)和acr3_(RP)分別與arsM共表達(dá)的重組菌的砷揮發(fā)能力為3.99%、5.65%和8.20%。由此可見,砷外排基因與砷甲基化基因共表達(dá)時(shí),砷外排蛋白將胞內(nèi)砷外排,限制了微生物砷甲基化能力。(3)基因敲除砷外排基因?qū)ξ⑸锷榧谆挠绊�。本研究分別敲除CGA009中砷外排基因arsB_(RP)和acr3_(RP),得到了?arsB_(RP)和?acr3_(RP)P 2個(gè)缺失突變株。對(duì)As(III)與As(V)抗性大小順序?yàn)橐吧?arsB_(RP)?acr3_(RP)。在100μmol/L As(III)孵育12 h,砷揮發(fā)率大小順序?yàn)橐吧?0.49%)?arsB_(RP)(3.61%)?acr3_(RP)(5.13%);25.0μmol/L As(V)孵育12 h,砷揮發(fā)率大小順序?yàn)橐吧?0.59%)?arsB_(RP)(4.25%)?acr3_(RP)(6.08%)。在As(III)揮發(fā)體系中,野生株和突變株均檢測(cè)低劑量的MAs(V)和DMAs(V),As(III)殘留含量高低順序?yàn)?野生株?arsB_(RP)?acr3_(RP)。由此可見,砷外排蛋白限制了微生物的砷甲基化,敲除砷外排基因可提高微生物砷甲基化效率,獲得了一株砷揮發(fā)能力較高的突變株(?acr3_(RP))�；蚯贸芯勘砻�:砷外排蛋白活性大小為Acr3_(RP)arsB_(RP),與砷生物傳感器(B系統(tǒng))研究的活性的順序不一致,其可能的原因是這2個(gè)外排蛋白在CGA009中位于不同的砷操縱子中,其表達(dá)量差異造成的。綜上,本研究建立了一種響應(yīng)胞內(nèi)砷濃度變化的插件式生物傳感器,首次比較了不同砷外排蛋白的活性,以及砷外排蛋白表達(dá)對(duì)微生物砷甲基化的影響。砷外排蛋白表達(dá)是限制微生物砷甲基化效率的重要遺傳因素之一,敲除砷外排基因可顯著提高微生物砷甲基化效率。本研究解釋了微生物砷甲基化效率低的一種原因,為選育高揮發(fā)性能微生物提供了有效策略。
【學(xué)位單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;X172
【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞對(duì)照表
第1章 緒論
    1.1 砷污染與危害
        1.1.1 砷的分布與來源
        1.1.2 砷的形態(tài)與毒性
        1.1.3 砷污染及現(xiàn)狀
        1.1.4 砷污染治理
    1.2 微生物的砷代謝研究
        1.2.1 As（III）氧化
        1.2.2 As（V）還原
        1.2.3 砷甲基化
        1.2.4 砷脫甲基化
        1.2.5 砷外排
    1.3 砷甲基化微生物在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用
    1.4 不產(chǎn)氧光合細(xì)菌砷代謝研究
    1.5 目前研究存在的問題、研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新性
第2章 生物傳感器法比較砷外排蛋白的活性
    2.1 材料和方法
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件
        2.1.2 主要試劑與儀器
        2.1.3 表達(dá)砷外排基因的重組菌的構(gòu)建與鑒定
        2.1.4 砷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
        2.1.5 表達(dá)砷外排基因的重組菌的砷抗性測(cè)定
        2.1.6 表達(dá)砷外排基因的重組菌的熒光強(qiáng)度測(cè)定
        2.1.7 表達(dá)砷外排基因的重組菌的砷形態(tài)測(cè)定
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 微生物砷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析
        2.2.2 質(zhì)粒的提取與砷外排基因的擴(kuò)增
        2.2.3 重組載體pUC19-Pars-gfp-arsRB/（acr3）C克隆和鑒定
        2.2.4 表達(dá)砷外排基因的重組菌的構(gòu)建與鑒定
        2.2.5 表達(dá)砷外排基因的重組菌的砷抗性比較
        2.2.6 表達(dá)砷外排基因的重組菌胞內(nèi)砷含量分析
        2.2.7 表達(dá)砷外排基因的重組菌的砷形態(tài)分析
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第3章 生物傳感器法研究砷外排蛋白對(duì)微生物砷甲基化的影響
    3.1 材料和方法
        3.1.1 試劑與儀器
        3.1.2 PCR擴(kuò)增arsM基因
        3.1.3 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的構(gòu)建與鑒定
        3.1.4 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的砷抗性測(cè)定
        3.1.5 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的熒光測(cè)定
        3.1.6 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的砷揮發(fā)能力測(cè)定
        3.1.7 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的砷形態(tài)測(cè)定
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 arsM基因的克隆與檢測(cè)
        3.2.2 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的構(gòu)建與鑒定
        3.2.3 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的砷抗性比較
        3.2.4 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的熒光強(qiáng)度比較
        3.2.5 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的砷揮發(fā)能力的測(cè)定
        3.2.6 共表達(dá)arsB/acr3與arsM的重組菌的砷形態(tài)分析
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第4章 砷外排蛋白基因敲除對(duì)微生物砷甲基化的影響
    4.1 材料與方法
        4.1.1 質(zhì)粒、菌株和試劑
        4.1.2 設(shè)計(jì)引物
        4.1.3 PCR擴(kuò)增目的基因
        4.1.4 重組菌E.coli（pJQ200SK-arsBRP/（acr3RP）UD）的構(gòu)建與鑒定
        4.1.5 自殺質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移
        4.1.6 砷外排基因的敲除與鑒定
        4.1.7 基因缺失突變株砷抗性的測(cè)定
        4.1.8 基因缺失突變株砷揮發(fā)能力的測(cè)定
        4.1.9 基因缺失突變株對(duì)砷轉(zhuǎn)化的測(cè)定
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 基因組DNA與質(zhì)粒的提取和目的基因擴(kuò)增
        4.2.2 自殺載體的構(gòu)建與鑒定
        4.2.3 砷外排基因缺失突變株的篩選和鑒定
        4.2.4 砷外排基因缺失突變株的生長(zhǎng)活性比較
        4.2.5 砷外排基因缺失突變株砷抗性的比較
        4.2.6 砷外排基因缺失突變株砷揮發(fā)能力的比較
        4.2.7 砷外排基因缺失突變株砷形態(tài)的分析
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第5章 結(jié)論和展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄A 相關(guān)試劑的配制
附錄B 基因敲除原理圖與砷代謝相關(guān)基因匯總
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果

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