本試驗旨在獲得典型苯酚污染環(huán)境中苯酚降解菌,篩選北方寒地苯酚高效降解菌并對其進行鑒定,優(yōu)化所篩選苯酚降解菌株的培養(yǎng)環(huán)境因素條件,為東北地區(qū)含酚污水生物處理提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)資料。將在化工廠、發(fā)電廠和生活廢水污染區(qū)采取的土樣、水樣和底泥做為菌種來源;應(yīng)用含酚培養(yǎng)基對采自于典型苯酚污染環(huán)境的微生物進行分離培養(yǎng);對所得耐酚菌株依次在苯酚濃度為500 mg·L~(-1)、700 mg·L~(-1)、900 mg·L~(-1)、1100 mg·L~(-1)的環(huán)境下進行反復(fù)馴化,從而篩選出北方寒地苯酚高效降解菌株;應(yīng)用16S rRNA基因測序,所得基因序列通過Blast進行同源序列搜索,確定其系統(tǒng)發(fā)育地位,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合細菌形態(tài)、接觸酶試驗、氧化酶試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、乳糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗、甲基紅試驗、靛基質(zhì)試驗、H_2S試驗、枸櫞酸鹽利用試驗等生理生化試驗,進行篩選菌株的菌種鑒定;根據(jù)接菌量、初始苯酚添加量、搖瓶裝量、溫度等因素的單因素試驗結(jié)果,應(yīng)用Design-Expert 10.0.7軟件進行響應(yīng)面法Box-Behnken實驗設(shè)計,對高效苯酚降解菌的培養(yǎng)環(huán)境因素進行優(yōu)化,以得到最佳培養(yǎng)環(huán)境條件。從采自于典型苯酚污染環(huán)境的試樣中,得到苯酚耐受菌株10株,其中具有苯酚降解能力的菌株5株,降酚能力較好的菌株1株。該菌株為革蘭氏陽性芽孢小桿菌,對慶大霉素和紅霉素敏感。經(jīng)16srRNA測序,對比基因序列數(shù)據(jù)庫鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。通過對接菌量、搖瓶裝量、苯酚添加量及溫度等影響苯酚降解菌株培養(yǎng)環(huán)境因素的探索,利用響應(yīng)面法對苯酚降解菌株培養(yǎng)環(huán)境因素進行優(yōu)化,得到四種因素對苯酚降解率的回歸方程,并計算出理論最佳降解培養(yǎng)環(huán)境因素條件為:接種量為7.63%(V/V),底物濃度為685.4 mg·L~(-1),搖瓶裝量為59.43 mL,溫度為27.54℃,理論苯酚最佳降解率為23.42%,與驗證試驗結(jié)果相符。經(jīng)過篩選與馴化,從采自北方寒地典型苯酚污染場所的試樣中得到苯酚降解能力較高的菌株。先進行富集培養(yǎng)與菌種分離,再進行反復(fù)馴化的方法可以篩選苯酚降解能力較高的菌株。與已報道比較,該菌株更適用于北方寒地較低的溫度條件。
【學(xué)位單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X172;X703
【部分圖文】：

吸光度 0.023 0.031 0.045 0.096 0.145 0.191 0.278 0.331苯酚濃度mg/mL 0.0000 0.0001 0.0002 0.0006 0.0010 0.0014 0.0020 0.0025圖6-1 苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 6-1 The standard curve of phenol concentration6.2 菌種的初篩從3 個采樣地點共篩選出 10 株在含酚 500mg·L-1牛肉膏蛋白胨平板上生長良好的耐酚菌，其中化工廠處5 株分別標(biāo)記為 H1、H2、H3、H4 和H5，發(fā)電廠處 2 株分別標(biāo)記為D1、D2，音達木河處 3 株分別標(biāo)記為Y1、Y2 和Y3。6.3 苯酚降解菌的馴化與復(fù)篩初篩后的10 株耐酚菌在苯酚為唯一碳源的無機鹽馴化培養(yǎng)基多次傳代馴化，進一步篩選出5 株具有降解能力的菌株，編號為 H2、H3、H5、D1 和Y3。其中化工廠三株，發(fā)電廠和音達木河各一株。在容積為 200mL 的錐形瓶中，加入 50.00 mL苯酚含量為500 mg·L-1無機鹽馴化培養(yǎng)基中

圖6-2 H5 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 6-2 Phylogenetic tree of H5 strain 高效降酚菌降酚條件的優(yōu)化.1 單因素實驗結(jié)果分別對接菌量、搖瓶裝量、苯酚初始濃度及溫度等四個培養(yǎng)環(huán)境因素進行單因素，為響應(yīng)面法優(yōu)化苯酚降解菌培養(yǎng)環(huán)境因素提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。.1.1 接菌量對 H5 降酚率的影響檢測不同接菌量對 H5 菌株苯酚降解率的影響，通過接菌量不同，其他條件相同用紫外可見光分光光度法，測量培養(yǎng)液中殘余苯酚含量。計算降解率，檢測苯酚降與不同接菌量之間的線性關(guān)系，結(jié)果如圖6-3。由降解率曲線變化規(guī)律可知隨著接種的增大，降解率先增加，后下降，這可能是由于菌體初始濃度過大，培養(yǎng)基的營養(yǎng)消耗過快，細菌代謝的有害物質(zhì)迅速在培養(yǎng)基中積累，不利于細菌的正常生長，因不是菌株接種量越大越好。

當(dāng)搖瓶裝量超過90.00 mL后降解率變化不大，見圖 6-4。之所以產(chǎn)生這樣的現(xiàn)象，應(yīng)與在不同裝量條件下系統(tǒng)內(nèi)溶氧量有關(guān)。圖6-4 搖瓶裝量對苯酚降解的影響Figure 6-4 The shake bottle loading quantity on phenol degradation6.5.1.3 苯酚初始濃度對不同濃度的苯酚降解情況如圖 6-5 所示，當(dāng)苯酚初始濃度逐步增加，苯酚降解率也隨之上升，苯酚初始濃度在 500 mg·L-1~700 mg·L-1之間H5 菌株的降解率維持較高水平，之后迅速下降。當(dāng)苯酚初始濃度超過 900mg·L-1后曲線平伸。
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本文編號：2884787