重金屬是植物生長(zhǎng)過(guò)程中重要的非生物脅迫因子,會(huì)直接危害植物的生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞的各項(xiàng)生理代謝功能。植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了不同的機(jī)制以減少重金屬離子鎘和銅等脅迫對(duì)植物造成的傷害,谷胱甘肽代謝途徑是重要機(jī)制之一,其中GR的作用十分關(guān)鍵。GR可將氧化型GSSG還原成還原型GSH,以高GSH/GSSG比例來(lái)保持植物細(xì)胞的高還原性,從而提升植物清除ROS的能力。百合是常見(jiàn)的花卉植物,具有觀賞性強(qiáng)、適種范圍廣、繁殖快等優(yōu)點(diǎn),所以改造價(jià)值很高。但其對(duì)重金屬的抵御能力較弱,因此可以通過(guò)分子水平改造,培育出對(duì)重金屬具有高耐受能力的百合,從而達(dá)到抵抗和修復(fù)重金屬環(huán)境的目的。本研究旨在使用模式植物煙草對(duì)抗逆基因LcGR進(jìn)行功能驗(yàn)證,并進(jìn)一步將該基因應(yīng)用于花卉綠化植物百合中。本研究獲得的成果如下:1.將從枸杞中克隆得到的LcGR基因在模式植物煙草中過(guò)表達(dá)后,檢測(cè)銅離子和鎘離子處理后煙草的株高、MDA含量、葉綠素含量、谷胱甘肽還原酶和過(guò)氧化氫酶活性等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株受重金屬離子傷害程度較小,生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯,生物酶活性顯著提高,表明導(dǎo)入該基因可顯著提高煙草對(duì)金屬銅和鎘離子的耐受性。而且在所有轉(zhuǎn)基因株系中,GR-10的耐受能力最強(qiáng);2.本研究為了提高百合對(duì)重金屬脅迫的耐受力,并進(jìn)一步改善周圍的土壤環(huán)境。以百合為材料,先利用正交試驗(yàn)優(yōu)化百合鱗片的組培再生體系。結(jié)果表明,使用MS+2 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L NAA+90 g/L蔗糖配比的培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)鱗片膨大的效果最佳;使用MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖配比的培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)鱗片直接分化的效率最高;使用MS+2.5 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L TDZ+60 g/L蔗糖配比的培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)鱗片間接分化的效率最高。再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LcGR基因轉(zhuǎn)化到百合中,并優(yōu)化了體系的各影響因素,最終獲得了轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明,在農(nóng)桿菌OD_(600)為0.6,受體預(yù)培養(yǎng)3 d,侵染40 min,AS濃度為200μM的條件下,鱗片的遺傳轉(zhuǎn)化效率最高,陽(yáng)性率高達(dá)17.50%。在農(nóng)桿菌OD_(600)為0.4,受體預(yù)培養(yǎng)5 d,侵染40 min,AS濃度為200μM的條件下,愈傷組織的轉(zhuǎn)化率最高,高達(dá)12.60%;3.本研究對(duì)得到的轉(zhuǎn)基因百合進(jìn)行銅離子和鎘離子的脅迫處理,并檢測(cè)其根長(zhǎng)、株高、MDA含量及GR和CAT生物酶活性等。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?表明在百合中過(guò)表達(dá)LcGR基因可顯著提其對(duì)重金屬的耐受性,為植物修復(fù)重金屬環(huán)境奠定了一定的研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X53;Q943.2
【部分圖文】：

圖 2-1 轉(zhuǎn)基因煙草移到盆中生長(zhǎng)Fig.2-1 Transgenic tobacco transferred from tissue culture flasks將攜帶外源基因LcGR的T1代煙草的種子撒在含有Kan MS瓊脂培養(yǎng)基的玻璃平板上篩選萌發(fā)，長(zhǎng)到兩個(gè)葉時(shí)轉(zhuǎn)移到組培瓶中培養(yǎng)至 4 葉期，然后轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)土中（營(yíng)養(yǎng)土：蛭石：珍珠巖中=1:1:1）盆栽培養(yǎng)兩周，期間的培養(yǎng)條件為：25 °C，3000 lx，16 h/d。植株的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖 2-1 所示，煙草苗顏色鮮綠、長(zhǎng)勢(shì)迅速、枝葉健壯，長(zhǎng)勢(shì)良好。從每個(gè)株系選出長(zhǎng)勢(shì)相同多株煙草植株，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.3.2 轉(zhuǎn)基因的煙草的 PCR 檢測(cè)鑒定結(jié)果

2-1 轉(zhuǎn)基因煙草移到盆中生長(zhǎng)genic tobacco transferred from tissue的T1代煙草的種子撒在含有K個(gè)葉時(shí)轉(zhuǎn)移到組培瓶中培養(yǎng)至珠巖中=1:1:1）盆栽培養(yǎng)兩周株的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖 2-1 所示，。從每個(gè)株系選出長(zhǎng)勢(shì)相同多CR 檢測(cè)鑒定結(jié)果

圖 2-3 轉(zhuǎn)基因煙草 LcGR 基因的 PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2-3 Electrophoresis of PCR product of LcGR in tobacco注： M 為 DNA Marker III，P 為質(zhì)粒對(duì)照，N 為非轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)照，L1-L9 為 LcGR 基陽(yáng)性 PCR 的電泳結(jié)果。經(jīng) Kan 篩選后，取正常生長(zhǎng)的煙草幼苗頂端向下的第 2 片葉片取葉片中的因組 DNA，再進(jìn)行 PCR 和半定量 PCR 檢測(cè)，進(jìn)一步確定外源基因 LcGR 在煙基因組中整合情況。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖 2-2 和圖 2-3 所示：非轉(zhuǎn)基因煙對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有出現(xiàn)與以質(zhì)粒 pCAMBIA2300-LcGR 為模板擴(kuò)增的產(chǎn)物相的 NPTII 和 LcGR 電泳條帶；而陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒和所選煙草均擴(kuò)增出了兩個(gè)目的帶，認(rèn)定在這些煙草植株中 LcGR 已經(jīng)整合到煙草的基因組中了。3.3 半定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果為進(jìn)一步確認(rèn)煙草轉(zhuǎn)基因整合情況和陽(yáng)性植株不同株系之間目的基因的基
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1 安婷;LcGR基因在煙草中的功能驗(yàn)證以及在百合抗重金屬中的應(yīng)用[D];天津大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2843018