【摘要】：為研究鎘(cadmium,Cd)暴露對斑馬魚(Danio rerio)早期胚胎發(fā)育和生殖細胞的毒性效應,本論文設(shè)置了6個鎘濃度組(0.00μmol/L、4.44μmol/L、8.90μmol/L、17.80μmol/L、26.70μmol/L、35.60μmol/L)對受精卵進行暴露。首先,分析了分裂期(2 hour post-fertilization(hpf))、原腸期(6 hpf)、體節(jié)期(10 hpf)和咽囊期(24hpf)胚胎畸形率和死亡率,證實了鎘對斑馬魚早期胚胎發(fā)育造成了嚴重的毒性作用。在此基礎(chǔ)上,通過檢測單獨鎘處理和鎘與N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)共同處理后胚胎活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化,明確了鎘暴露對斑馬魚早期胚胎的氧化損傷效應及NAC對鎘致斑馬魚胚胎氧化損傷的保護作用。進一步,通過實時熒光定量PCR檢測了鎘暴露后2 hpf、6 hpf、10 hpf和24 hpf胚胎的生殖調(diào)控基因vasa、nanos1、piwi、dazl表達量的變化,揭示了鎘暴露對斑馬魚早期胚胎生殖調(diào)控基因表達的影響。本研究為探討鎘暴露對早期胚胎生殖發(fā)育毒性的效應機制提供了理論依據(jù)。實驗結(jié)果如下:1.鎘暴露對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的毒性效應不同濃度鎘暴露造成早期胚胎畸形發(fā)育,導致胚胎死亡。鎘濃度高于8.90μmol/L時,2 hpf、6 hpf、10 hpf和24 hpf胚胎的畸形率均極顯著性升高(P0.01)。胚胎表現(xiàn)為包狀突起、分裂異常、外包延遲、卵黃囊水腫、尾部彎曲等畸形表型。死亡率分析顯示,2 hpf胚胎的死亡率無顯著性變化(P0.05),而6 hpf、10 hpf和24 hpf胚胎在鎘濃度高于8.90μmol/L時其死亡率均極顯著增加(P0.01)。2.鎘暴露對斑馬魚早期胚胎的氧化損傷效應DCFH-DA熒光探針標記檢測ROS結(jié)果顯示,鎘暴露后斑馬魚早期胚胎ROS含量逐漸增強,呈現(xiàn)濃度效應關(guān)系。尤其鎘濃度高于8.90μmol/L時ROS含量顯著升高(P0.05)。與單獨鎘處理組相比,鎘和抗氧化劑NAC共同處理胚胎后,ROS含量降低,恢復至正常水平。結(jié)果表明,鎘誘導早期胚胎中ROS的大量產(chǎn)生。MDA含量和SOD活性檢測結(jié)果顯示,鎘暴露后早期胚胎MDA含量均隨鎘濃度升高逐漸增加,17.80μmol/L和35.60μmol/L鎘濃度組MDA含量顯著高于對照組。SOD活性在低濃度鎘暴露后活性升高,在高濃度鎘暴露后活性被抑制。17.80μmol/L和35.60μmol/L鎘濃度暴露下,胚胎SOD活性均被顯著抑制(P0.05)。而與單獨鎘處理組相比,鎘和NAC共同處理胚胎后,MDA含量下降,SOD活性升高,均趨于正常水平。研究證實鎘暴露對斑馬魚早期胚胎造成了嚴重的氧化損傷。3.鎘暴露對斑馬魚早期胚胎生殖調(diào)控基因表達的影響通過實時熒光定量PCR檢測了鎘暴露后斑馬魚胚胎中生殖調(diào)控基因表達量的變化。結(jié)果顯示,與對照組相比,鎘暴露后胚胎發(fā)育至2 hpf時,vasa、nanos1、piwi、dazl的表達量均未見顯著變化;鎘暴露胚胎發(fā)育至6 hpf時,nanos1在17.80μmol/L和35.60μmol/L鎘濃度下表達量顯著降低;鎘暴露胚胎發(fā)育至10 hpf,vasa表達量在鎘濃度高于8.90μmol/L時顯著下降,nanos1表達量在鎘濃度高于17.80μmol/L時顯著下降;鎘暴露胚胎發(fā)育至24 hpf時,vasa、nanos1、piwi、dazl在鎘濃度為17.80μmol/L、35.60μmol/L時表達量均顯著性降低(P0.05)。鎘和NAC共同處理組與單獨鎘處理組相比,基因表達量升高,基本恢復正常水平。綜合以上研究結(jié)果,得出以下結(jié)論:(1)鎘暴露導致斑馬魚早期胚胎畸形率、死亡率顯著性增高。發(fā)育至不同時期的胚胎均表現(xiàn)出多種畸形表型,甚至可導致胚胎死亡。特別地,發(fā)育至原腸期和體節(jié)期的胚胎死亡數(shù)顯著增加。(2)鎘暴露導致早期胚胎中ROS的大量產(chǎn)生,使得MDA含量的增加,SOD活性下降,對胚胎造成了嚴重的氧化損傷。(3)鎘暴露對生殖調(diào)控基因的表達有不同程度的影響。鎘暴露斑馬魚早期胚胎后,導致生殖調(diào)控基因vasa、nanos1、piwi、dazl的表達量均顯著性降低,尤其對vasa、nanos1的表達量影響更為顯著。研究證明鎘暴露抑制了斑馬魚早期胚胎生殖相關(guān)基因的表達。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：X503.225;S917.4
【圖文】：

PGCs發(fā)生與遷移[62]

物級均勻快速分裂，而鎘濃度組胚胎出現(xiàn)包狀突起、未分裂、分裂異常、分裂延遲、甚至分裂停止等畸形表型（圖 2.1 B-F）。圖2.1 鎘暴露后2 hpf胚胎的畸形率分析（n=10）Ⅰ：鎘暴露后2 hpf胚胎的畸形率；Ⅱ：鎘暴露后2 hpf胚胎的畸形表型圖 A，正常發(fā)育胚胎（64-細胞）； B-F，畸形發(fā)育胚胎Fig. 2.1Analysis of deformity rate of 2 hpf embryos after cadmium exposureI: Deformity rate of 2 hpf embryos after cadmium exposure (n=10); II:Analysis of abnormal phenotypeof 2 hpf embryos after cadmium exposure.A, normal embryos (64-cell); B-F, malformed embryos

I: Deformity rate of 6 hpf embryos after cadmium exposure; II:Analysis of abnormal phenotype of 6hpf embryos after cadmium exposure.A, normal embryos (50%-epiboly); B-F, malformed embryos圖2.3 鎘暴露后10 hpf胚胎的畸形率分析（n=10）Ⅰ：鎘暴露后10 hpf胚胎的畸形率；Ⅱ：鎘暴露后10 hpf胚胎的畸形表型圖。A，正常發(fā)育胚胎（3-體節(jié)）；B-D，畸形發(fā)育胚胎Fig. 2.3Analysis of deformity rate of 10 hpf embryos after cadmium exposure (n=10)I: Deformity rate of 10 hpf embryos after cadmium exposure; II:Analysis of abnormal phenotype of 10hpf embryos after cadmium exposure.A, normal embryos (3-somite); B-D, malformed embryos

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本文編號：2807019