【摘要】：次氯酸鹽(HClO/ClO~-)常被用作實(shí)際生活中的漂白劑和消毒劑,但是在使用的過程當(dāng)中,常會產(chǎn)生各種含氯副產(chǎn)物,如氯氣、氯酸鹽等,過量的HClO/ClO~-會潛在的危害人體,對生命體內(nèi)的細(xì)胞、組織造成一定程度的損傷。機(jī)體的內(nèi)源性HClO/ClO~-是在細(xì)胞里的髓過氧化物酶MPO的催化下由過氧化氫(H_2O_2)與氯離子(Cl~-)作用產(chǎn)生,其對于調(diào)節(jié)生命體的氧化還原平衡、調(diào)控細(xì)胞的生命周期及傷口的修復(fù)和組織的再生有著重要的作用。目前檢測HClO/ClO~-的方法主要有比色法、電化學(xué)法及化學(xué)發(fā)光等方法,但是這些技術(shù)均會或多或少的損傷細(xì)胞,進(jìn)而便不利于檢測生命系統(tǒng)中的活性物質(zhì)。氟離子(F~-)和肼(N_2H_4)廣泛的應(yīng)用于實(shí)際水體以及工業(yè)生產(chǎn)過程中,過量的話則會成為環(huán)境污染物質(zhì)并對環(huán)境產(chǎn)生毒害作用,當(dāng)人體長時間暴露于此便會造成極大程度的損傷,另外F~-作為最小并且電負(fù)性最強(qiáng)的陰離子,由于其體積較小,因而檢測十分困難。目前檢測該種環(huán)境污染物的方式主要有色譜法,滴定法,電化學(xué)法,Willard-Winter法等,同樣的,這些方法不適合于檢測生命體系中的物質(zhì)。近年來,針對特定目標(biāo)物質(zhì)的分析檢測而設(shè)計的一類具有熒光性質(zhì)的熒光分子探針憑借其較高的靈敏度和選擇性、對樣品的損傷小甚至可以可視化實(shí)時成像的優(yōu)點(diǎn)在生物化學(xué)分析方向逐步發(fā)展,這種技術(shù)有助于對環(huán)境污染物及疾病標(biāo)志物進(jìn)行評價、分析和診斷。另外,由探針制備的檢測試紙可直觀的對環(huán)境中污染物進(jìn)行定性檢測,所以整體來說,熒光探針的技術(shù)也逐漸的用于實(shí)際樣品的檢測分析中�；诖�,制備了三種熒光分子探針用于目標(biāo)物在實(shí)際水樣及細(xì)胞中的檢測,并且制成了便攜的檢測試紙。本文主要內(nèi)容如下:(1)香豆素類次氯酸熒光探針的合成和應(yīng)用基于HClO可裂解出具有很強(qiáng)的親電作用的Cl~+,因而實(shí)驗設(shè)計了用于特異性識別HClO的熒光探針二甲基硫代氨基甲酸-O-(4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基)酯(DAME),通過核磁圖譜及其他手段對探針DAME及反應(yīng)后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。探針DAME自身無熒光,但與分析物HClO反應(yīng)后的熒光會明顯增強(qiáng)。探針DAME以二甲氨基硫代甲酰氯為受體,親電的Cl~+會攻擊該識別位點(diǎn),從而釋放香豆素的熒光,該探針的激發(fā)和發(fā)射波長分別位于370 nm和453 nm。探針DAME可以在其他種類活性氧(ROS)的存在下,高選擇性地檢測HClO。探針DAME檢測HClO的線性范圍為0-50μmol L~(-1),此時探針的檢出限為34.75 nmol L~(-1)。用DAME孵育PC-12細(xì)胞,利用顯微鏡對外加的不同濃度HClO的PC-12細(xì)胞進(jìn)行成像,結(jié)果表明探針DAME可用于檢測PC-12細(xì)胞中外源性不同濃度HClO。此外,探針DAME的試紙被成功用于追蹤實(shí)際環(huán)境樣品中HClO的濃度。(2)紅光發(fā)射的次氯酸根熒光探針由于較長的發(fā)射波長的光能滲透深層組織,減少對生物組織的光損傷和自發(fā)熒光的干擾,所以在上一項工作的基礎(chǔ)上,基于ClO~-的強(qiáng)氧化性,合成了具有長波長發(fā)射的熒光探針3-氨基-10-二乙氨基-5-6-二氫苯并[c]黃烷(probe 1)用于在生理條件下特異性檢測ClO~-,探針probe 1的激發(fā)為570 nm,發(fā)射在630 nm處。結(jié)果表明探針probe 1在pH 7-8的環(huán)境下可對HClO,HClO/ClO~-,ClO~-體系加以區(qū)分。ClO~-探針probe 1線性范圍0-10μmol L~(-1),檢出限2.41 nmol L~(-1)。利用顯微鏡對探針probe 1孵育的PC-12細(xì)胞、脂多糖(LPS)刺激后的PC-12細(xì)胞、LPS和4-氨基苯甲酰肼(ABH)處理后的PC-12細(xì)胞及外源性不同濃度ClO~-處理后的PC-12細(xì)胞進(jìn)行成像,結(jié)果表明探針probe 1可以對PC-12細(xì)胞的內(nèi)、外源性的ClO~-進(jìn)行成像。實(shí)驗也制備了檢測試紙用于對實(shí)際樣品的分析。與第一項工作相比,探針probe 1的發(fā)射波長、響應(yīng)時間及檢出限都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于探針DAME,并且長波長的優(yōu)點(diǎn)也支撐細(xì)胞實(shí)驗用于對PC-12細(xì)胞的內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行分析。(3)檢測氟離子和肼的雙功能熒光探針一個探針對多種物質(zhì)的檢測根據(jù)文獻(xiàn)得知是具有雙功能性質(zhì)的,這種性質(zhì)為環(huán)境物質(zhì)的檢測提供了更為便捷的工具,可以設(shè)計一個探針在不同的體系當(dāng)中對污染物進(jìn)行定性及定量分析。因此,實(shí)驗以對硝基苯磺酰氯作為F~-和N_2H_4的識別基團(tuán)合成了4-硝基苯磺酸4-甲基-2-氧代-2H-色氨酸-7-酯(probe 2)。探針probe 2本身無熒光,但當(dāng)探針probe 2溶于PBS緩沖液檢測N_2H_4時,由于N_2H_4的親核作用會引起發(fā)生親核芳香取代反應(yīng),從而使淬滅基團(tuán)附近的電子云密度發(fā)生變化,致使熒光被釋放。當(dāng)探針probe 2溶于無水乙腈溶劑檢測F~-時,利用對硝基苯磺酰氯的去保護(hù)作用,從而熒光團(tuán)的熒光被釋放。探針probe 2可以在不同的溶劑體系中高選擇性的檢測N_2H_4和F~-并且不受其他相關(guān)離子及化合物的影響。探針檢測F~-檢出限為77.82 nmol L~(-1),檢測N_2H_4檢出限低至29.34nmol L~(-1),這個數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國環(huán)保署所規(guī)定的閾限值。為了開發(fā)探針probe 2的實(shí)際用途,實(shí)驗設(shè)計了檢測試紙用于F~-和氣態(tài)N_2H_4的定性檢測,同時由于探針檢測N_2H_4的體系是在PBS緩沖液中,所以probe 2也成功用于活細(xì)胞中低濃度N_2H_4的檢測,展示了探針生物學(xué)方面的應(yīng)用前景。總體來看,設(shè)計的三種熒光分子探針在不斷的優(yōu)化探針的性能,并且均用于對實(shí)際樣品的分析,紅光發(fā)射的熒光探針甚至用于對內(nèi)源性活性物質(zhì)的檢測,因此,通過不斷的對探針的發(fā)射波長及應(yīng)用的改進(jìn),將對分析物的生物學(xué)應(yīng)用有著更為直觀的分析和檢測。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X832
【圖文】：

質(zhì)的分析也變得日益重要，因而需要開發(fā)一種可以實(shí)時進(jìn)行成像并對比，進(jìn)而對癌癥進(jìn)行精確的分析。熒光探針擇性，用于可視化實(shí)時檢測成像的技術(shù)[1-5]，近年來科學(xué)于對環(huán)境樣品、細(xì)胞甚至活體中的物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，從的作用機(jī)理。的概述探針的組成為特定的檢測物而設(shè)計的一類具有熒光性質(zhì)的分子。通過變化，來判斷并確定探針分子是否適合用于該物質(zhì)的檢測如圖 1-1 所示）主要是由：（1）熒光團(tuán)；（2）連接基團(tuán)，可將二者連接；（3）受體，與待測物相互作用。

圖 1-2）作為一種氧雜蒽類化合計當(dāng)中。如圖 1-3 所示，當(dāng)羅丹析物作用之后，羅丹明結(jié)構(gòu)上的從無熒光到有熒光，屬 turn-on 型于羅丹明類、香豆素類及氟硼吡

烯分子（TPE）等。羅丹明類[10-12]（如圖 1-2）作為一種氧雜蒽類化合物，由于其較為清常被用于探針的設(shè)計當(dāng)中。如圖 1-3 所示，當(dāng)羅丹明的螺內(nèi)酰胺環(huán)處無熒光的，但與分析物作用之后，羅丹明結(jié)構(gòu)上的環(huán)會打開，增大母有較強(qiáng)的熒光發(fā)射。從無熒光到有熒光，屬 turn-on 型的探針，相反則是組近年來主要致力于羅丹明類、香豆素類及氟硼吡咯類物質(zhì)的設(shè)計、圖 1-2 羅丹明類物質(zhì)結(jié)構(gòu)

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本文編號：2786716