發(fā)布時間：2020-06-07 23:27

【摘要】：在自然環(huán)境中,飲用水水源很容易受到病原微生物的侵染,被污染的水體中,通常能檢測出大量的致病菌和腸道病毒。大腸桿菌作為水源中病原菌的標準指示菌,對水質安全監(jiān)測具有重要意義,我國國標GB5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標準中嚴格規(guī)定：飲用水的大腸桿菌限值為每1 OOmL不得檢出。然而,目前大腸桿菌的標準檢測方法仍以傳統(tǒng)檢測方法為主,這些檢測方法耗時長、操作繁瑣,不適合對水樣進行實時監(jiān)控。如何快速準確檢測出水體中大腸桿菌稱為人們研究的熱點。本論文圍繞大腸桿菌快速檢測來展開研究工作,選取高特異性、高靈敏度的PCR和具有準確定量的FRET原理來實現(xiàn)對大腸桿菌的檢測。首先建立普通PCR法。選取大腸桿菌的特異性保守性基因uidA作為目標檢測物,對uidA進行引物設計后進行PCR實驗,在保證引物的特異性和準確性后克隆成質粒,并根據(jù)質粒對PCR擴增的反應體系和反應條件進行篩選和調控,最后得到最佳的PCR擴增條件。然后建立QDs-Cy5基的FRET檢測體系。選取反應條件溫和的水相回流法來合成CdTe量子點,通過調節(jié)回流時間得到一系列發(fā)光效率較好的量子點。選取量子產率為53%、發(fā)射在602 nm的CdTe量子點為FRET的供體,根據(jù)Forster原理對比量子點與染料的吸收和發(fā)射光譜,選取在600 nm左右有較強吸收的花菁染料Cy5作為FRET的受體。根據(jù)目的DNA設計的一組適配子,與供受體對連接后形成捕獲探針和報告探針,兩組探針可與目的DNA特異性結合形成夾心結構并通過FRET來實現(xiàn)對目的DNA的檢測。對檢測中可能影響的因素進行適當調控后,成功對uidA基因進行了檢測,其檢測限為2nmol/L,且在2nmol/L-100 nmol/L范圍內有良好的線性關系,線性系數(shù)為0.999。最后聯(lián)立PCR-FRET,其可在3h內完成對大腸桿菌的檢測。對uidA基因的檢測結果顯示其可檢測到30copies的uidA,比普通PCR法的檢測限約低一個數(shù)量級；該方法可檢測大腸桿菌濃度在103-107 CFU/mL范圍內的水樣,最后對實際水樣進行了檢測,檢測結果與平板法和普通PCR法結果相一致,但準確度還有待進一步提高。
【圖文】：

是Ｍｉｌｌｕｓ和Ｃｅｔｕｓ于１９８３年在Ｓｃｉｅｎｃｅ雜志上發(fā)表的一種體外ＤＮＡ快速擴增技術，其逡逑模擬生物體內ＤＮＡ復制過程，Ｗ目的ＤＮＡ為模板，在ＤＮＡ聚合酶的作用下，使ＤＮＡ逡逑數(shù)量呈指數(shù)形式增加。其原理分為Ｈ個步驟（如圖１．１所示）。逡逑第一步高溫變性，，在９０－９６°Ｃ較高溫度下，雙鏈ＤＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ邋ＤＮＡ，ｄｓＤＮＡ）逡逑中的氨鍵斷裂，解旋為兩條單鏈ＤＮＡ邋（Ｓ虹ｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡ，ｓｓＤＮＡ）；逡逑第二步低溫退火，在４５－６５°Ｃ較低溫度下，引物根據(jù)堿基互補配對原則，與兩條模逡逑板ＤＮＡ結合形成局部雜交鏈；逡逑第Ｈ步中溫延伸，在７０－７５‘Ｃ時，耐熱ＤＮＡ聚合酶４種核巧酸（腺V蚜牒飼傷徨義希洌粒裕�、胸腺锣y珊飼傷幔洌裕裕�、鸟嘿吟猴晜ｄ吭Ｐ、胞鄬\宋羲幔洌茫裕校┪瓘/，從逡逑引物的３’端開始，｛＾目的０？八單鏈為模板，從５’－３’的方向合成互補鏈。逡逑經過這三個步驟（一個熱循環(huán)）后，一個ｄｓＤＮＡ分子擴增為２個具有同樣堿基序逡逑列的ｄｓＤＮＡ分子。隨著Ｈ個步驟的循環(huán)往復

量轉移給染料，使得ＤＮＡ－染料復合物發(fā)射的英光強度比游離的染料發(fā)射的巧光強度大逡逑得多。常用的核酸染料巧澳化乙錠化出ｉｄｉｕｍ邋Ｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）、ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ和ＧｅｌＲｅｄ逡逑等，巧中，ＥＢ與ＤＮＡ的結合如圖１．２所示。Ｑｉｎｇ邋ｔｉｕａｎｇ等人Ｐ７哺Ｍ．Ｃ．Ｍ．邋Ｃｏｕｔｏ等人逡逑ｐｓｊ比較了邋ＥＢ、ＳＹＢ民Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ和ＧｅｌＲｅｄ三種核酸染料對ＰＣ民凝膠電泳結果的影響，結逡逑果顯示：靈敏度說化６（１＞５￥８１１６化６１１１＞￡８，且0６１民６（］不僅靈敏度較其他二者高，而逡逑且穩(wěn)定性好、對化物體毒性較小。逡逑－８邋－逡逑
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TU991.21;X832

【共引文獻】

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本文編號：2702154