【摘要】：黃海歷年大規(guī)模綠潮系由滸苔(Ulva prolifera)單一生態(tài)型構(gòu)成,提示其生物學(xué)特性是綠潮暴發(fā)的重要成因之一。藻類(lèi)共附生細(xì)菌密切參與宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收、形態(tài)建成等關(guān)鍵過(guò)程,這為黃海綠潮的遺傳溯源與暴發(fā)機(jī)制研究提供了新角度。與附生菌相比,內(nèi)生菌與宿主的特異性往往更加穩(wěn)定,有必要開(kāi)展差異性分析,但相關(guān)研究的方法學(xué)基礎(chǔ)尚未建立。本文首先使用16S rDNA通用引物,對(duì)漂浮與定生滸苔共附生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律與問(wèn)題:1)在細(xì)菌門(mén)和科的水平,漂浮與定生群體間存在明顯差別;2)發(fā)現(xiàn)CFB、浮霉菌等功能類(lèi)群,但CFB缺乏功能驗(yàn)證方法,浮霉菌占比與文獻(xiàn)有顯著差異,提示須對(duì)內(nèi)生菌與附生菌區(qū)別研究;3)滸苔葉綠體DNA對(duì)擴(kuò)增具嚴(yán)重影響,須開(kāi)展引物優(yōu)化或設(shè)計(jì)。針對(duì)上述方法學(xué)瓶頸,我們通過(guò)比較化學(xué)、物理、酶解等十幾種消毒方法,發(fā)明了用特定粒徑石英砂與滸苔共震蕩以徹底清除附生菌的高效方法并優(yōu)化了參數(shù),DGGE結(jié)果表明,新方法對(duì)內(nèi)生菌幾無(wú)影響,可以用于內(nèi)、附生菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析。為了消除藻類(lèi)葉綠體編碼16S rDNA同源序列對(duì)內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析的嚴(yán)重影響,共建立兩種引物優(yōu)化方案:一是從引物設(shè)計(jì)、熱啟動(dòng)、退火溫度三個(gè)方面優(yōu)化現(xiàn)有799F引物,可顯著降低葉綠體來(lái)源擴(kuò)增產(chǎn)物的比例,揭示了優(yōu)化原理;二是通過(guò)比較滸苔葉綠體與31個(gè)細(xì)菌門(mén)類(lèi)的16S同源序列,發(fā)現(xiàn)了位于高度保守區(qū)的唯一雙堿基差異位點(diǎn),設(shè)計(jì)了新引物1525R,經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn),可完全排除葉綠體影響。綠潮滸苔高度分枝、利于漂浮,是區(qū)別于定生群體的顯著形態(tài)差異,CFB細(xì)菌是參與滸苔形態(tài)建成(MG)的重要功能類(lèi)群。本文用CFB細(xì)菌特異引物對(duì)8個(gè)漂浮與定生滸苔群體進(jìn)行了分析比較,分離鑒定獲得了可培養(yǎng)的CFB菌株,利用抗生素法建立了滸苔無(wú)菌發(fā)育實(shí)驗(yàn)體系,將用于菌株的MG功能驗(yàn)證。本文建立了附生菌選擇性去除、16S引物優(yōu)化與設(shè)計(jì)、無(wú)菌發(fā)育實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建等關(guān)鍵方法,為后續(xù)開(kāi)展?jié)G苔共、附生菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析及功能類(lèi)群的檢驗(yàn)奠定了必要的方法學(xué)基礎(chǔ)。
[Abstract]:The large green tide of Huang Hai over the years is composed of a single ecotype of Enteromorpha enteromorpha, indicating that its biological characteristics are one of the important causes of green tide outbreak. Algae co-epiphytic bacteria are closely involved in the host nutrient absorption, morphogenesis and other key processes, which provides a new perspective for the genetic traceability and outbreak mechanism of Huang Hai green tide. The specificity of endophytic bacteria and host is more stable than that of epiphytic bacteria, so it is necessary to carry out diversity analysis, but the methodological basis of related studies has not been established. In this paper, using 16s rDNA universal primers, the community structure of coepiphytic bacteria of floating and stationary Enteromorpha enteromorpha was compared and analyzed. It was found that the following laws and question: 1) were found to be at the level of phylum and family. There were significant differences between floating and metaplastic populations (2) the functional groups such as CFB and floating fungi were found, but CFB was lack of functional verification method, and the proportion of floating fungi was significantly different from that in literature. It is suggested that the difference between endophytic and epiphytic bacteria should be studied. 3) chloroplast DNA of Enteromorpha enteromorpha has a serious effect on amplification and primer optimization or design should be carried out. In view of the above methodological bottlenecks, we have developed a highly efficient method of eliminating epiphytic bacteria thoroughly by shaking together with quartz sand and enteromorpha with specific particle size by comparing a dozen disinfection methods such as chemistry, physics and enzymatic hydrolysis, and optimizing the parameters of DGGE. The new method has little effect on endophytic bacteria and can be used to analyze the difference of endophytic bacteria community structure. In order to eliminate the serious influence of the 16s rDNA homologous sequence encoded by algae chloroplast on the analysis of endophytic community structure, two primer optimization schemes were established: one was to optimize the existing 799F primers from three aspects: primer design, hot start and annealing temperature. By comparing the 16s homologous sequences of chloroplasts with 31 bacteria species, we found the only double base difference site located in highly conserved region of Enteromorpha enteromorpha by reducing the proportion of chloroplast products derived from chloroplast and revealing the principle of optimization, and comparing the 16s homologous sequences of chloroplasts with 31 bacterial families. A new primer 1525 Rwas designed and sequenced. Green tide Enteromorpha enteromorpha is highly branched and easy to float, which is a significant morphological difference from Dingsheng population. CFB bacteria are important functional groups involved in the morphogenetic (MG) of Enteromorpha enteromorpha. In this paper, CFB bacteria specific primers were used to analyze and compare 8 floating and stationary populations of Enteromorpha enteromorpha. The culturable CFB strains were isolated and identified. The aseptic development test system of Enteromorpha margin was established by using antibiotic method, which will be used to verify the MG function of the strains. In this paper, the key methods, such as the optimization and design of 16s primer for selective removal of epiphytic bacteria and the construction of aseptic development experiment system, were established for the subsequent development of Enteromorpha enteromorpha. The difference analysis of epiphytic community structure and the examination of functional groups lay the necessary methodological foundation.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：X55

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5 丁月e，

本文編號(hào)：2160047