本文關鍵詞： 產氣腸桿菌 生物制氫 厭氧發(fā)酵 基因敲除 響應面法 氫酶　出處：《華中科技大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：隨著當前化石能源危機以及其引發(fā)的全球氣候變化和環(huán)境污染的日益嚴重,對清潔環(huán)保的綠色能源開發(fā)與探索顯得更為迫切。氫能作為一種能量密度大、可再生、清潔環(huán)保的綠色可替代能源受到廣泛關注。在諸多產氫技術中,厭氧發(fā)酵產氫技術具有反應條件溫和、反應器設計簡單及可利用廉價有機廢物制備等特點,使其成為氫能源和環(huán)保領域研究熱點。但厭氧發(fā)酵較低的產氫效率一直是技術瓶頸,嚴重制約產業(yè)化發(fā)展。因此,厭氧發(fā)酵制氫對高效產氫菌的選育尤為重要,成為當前厭氧發(fā)酵制氫工業(yè)化的研究重點,目前利用基因工程和輔酶工程等新技術選育高效產氫工程菌成為研究熱點方向之一。本研究以產氣腸桿菌Enterobacter aerogenes CCTCC AB91102為出發(fā)菌株,該菌株具有易于培養(yǎng)、底物適用范圍廣和發(fā)酵周期短等諸多優(yōu)點,使之成為具有工業(yè)化潛力的產氫菌種之一。產氣腸桿菌厭氧發(fā)酵是一個相對復雜的代謝過程,對其產氫代謝的研究包括甲酸裂解途徑和NADH途徑。通過甲酸裂解途徑的氫酶基因的同源表達,增加氫酶的表達量,從而達到提高工程菌產氫效率的目的。此外,還對其發(fā)酵條件做了優(yōu)化,以進一步提高產氫量。同時,針對產氣腸桿菌另一產氫途徑(NADH途徑)展開了代謝機理初步探索。主要研究內容和結果摘要如下:1.構建了過表達氫酶-3亞基的同源重組工程菌AB91102-hyc E和AB91102-hyc G。以產氣腸桿菌E.aerogenes AB91102基因組DNA為模板,擴增得到氫酶-3大亞基(Hyc E)hyc E基因(Gen Bank No.KM096473)、膜結合蛋白(Hyc F)hyc F基因(Gen Bank No.KM096474)以及小亞基(Hyc G)hyc G基因(Gen Bank No.KM096475)。針對hyc E和hyc G兩個基因成功構建了表達質粒p ET28a-Pkan-hyc E和p ET28a-Pkan-hyc G,并將表達質粒轉入產氣腸桿菌AB91102中,獲得AB91102-hyc E和AB91102-hyc G兩株高效工程菌。基因工程菌產氫特性研究結果顯示,工程菌產氫效率較原始菌株分別提高11.51%和6.77%。發(fā)酵液成分及產氫貢獻分析表明:基因工程菌甲酸裂解途徑的產氫量分別提高了5.4%和1.9%,NADH途徑的產氫量分別提高了54.8%和40.6%。該結果表明氫酶-3亞基過表達不僅可提高甲酸裂解途徑產氫,而且可促進NADH途徑產氫。2.優(yōu)化工程菌E.aerogenes AB91102-hyc E厭氧發(fā)酵條件。首先,采用單因素優(yōu)化了影響發(fā)酵的關鍵參數接種量、溫度和初始p H,結果表明:最適接種量為10%,最適溫度為35°C,最適初始p H為6.0。在單因素優(yōu)化基礎上,進一步運用Central Composite Design(CCD)設計實驗,利用統(tǒng)計學軟件SAS 9.0分析和預測響應值。預測最優(yōu)發(fā)酵條件:接種量為11.6%,溫度為34.6°C,初始p H值為6.07。厭氧發(fā)酵產氫驗證實驗得到的實際產氫效率為1.175 mol H2/mol葡萄糖,與模型預測值1.169mol H2/mol葡萄糖非常接近,表明預測模型的可靠性。3.考察了產氣腸桿菌氫酶-3的Hyc E、Hyc F和Hyc G亞基功能。利用Red重組系統(tǒng)完成抗性標記基因與氫酶-3基因進行同源重組,從產氣腸桿菌基因組成功分別敲除了hyc E、hyc F和hyc G基因,并消除抗性基因,獲得突變菌株分別命名為AB91102-Δhyc E、AB91102-Δhyc F和AB91102-Δhyc G。厭氧恒化實驗結果表明,突變菌株總NAD(H)濃度變化不大,但NADH/NAD+比值從1.06分別提高到1.39、1.45和1.41,對于葡萄糖的攝取量分別下降了47.85%、46.49%和48.95%。厭氧批次發(fā)酵實驗表明,突變菌株的產氫量降至零,葡萄糖的攝取量分別下降了35.1%、34.5%和36.0%。此外,突變菌NADH途徑的產氫量為零,參與NADH途徑的氫酶檢測不到活性,表明氫酶-3基因敲除對甲酸裂解途徑和NADH途徑均產生阻斷或抑制的作用,是產氣腸桿菌復雜產氫途徑的關鍵酶。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TQ116.2;TQ929

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