發(fā)布時間：2020-11-15 11:06

　　 miRNA是一類非編碼小RNA,在癌癥細胞中表達異常,常作為癌癥的標志物。miRNAs常見的檢測方法有微陣列法,miRNA測序法,PCR。其中PCR是分子生物學研究的一種極其重要的工具,經(jīng)過多年研究,PCR從定性分析發(fā)展為定量分析。為了適用于復雜的實驗場景,PCR儀的一個發(fā)展方向是設備的便攜化,PCR儀便攜化的關鍵是PCR微流控技術。PCR微流控技術分為空間域PCR和時間域PCR,空間域PCR技術反應時間短、和上下游模塊易組合的優(yōu)勢,吸引了研究者的興趣。PCR微流控芯片傳統(tǒng)制備技術以軟光刻為主,操作復雜、制備時需要大型儀器、技術要求高等缺點制約了它的進一步發(fā)展。近年來,一種新的微流控制備技術3D打印技術開始應用于微流控芯片的制備,它的制備過程基本上不需要人工操作,操作簡單,并且成本比較低。但是,使用3D打印技術制備PCR微流控芯片的研究較少。本文基于以上研究現(xiàn)狀,采用3D打印技術制備液滴PCR微流控芯片,并制備便攜式液滴PCR儀,檢測癌癥細胞中的miRNA。首先,本文設計了四種空間域PCR芯片,探究微流控通道的形狀和尺寸設計,初步實驗表明電熱蛇型PCR芯片具有加熱快、加熱元件形狀易加工、可設置多個循環(huán)等優(yōu)勢,所以選用該芯片進行后續(xù)研究。進一步計算PCR實驗時微流控芯片通道流量,探究持續(xù)相和分散相不同流量下液滴的生成性能,實現(xiàn)小的液滴生成。為了在較短時間內(nèi)完成PCR實驗,選定持續(xù)相23μL/min,分散相1μL/min為后續(xù)實驗的流量設置。然后,本文構建了PI加熱膜控溫系統(tǒng)、加熱陶瓷控溫系統(tǒng)、筒式加熱器控溫系統(tǒng),探究3D打印的PCR微流控芯片在同一流量設置時,三種控溫系統(tǒng)下芯片的溫度分布情況。對三種控溫系統(tǒng)下芯片的溫度分布進行紅外圖像處理,溫度值分析后,筒式加熱器較快的加熱速度,良好的均一性和穩(wěn)定性的特點,有利于PCR實驗成功。因此選用筒式加熱器控溫系統(tǒng)進行下一步液滴PCR實驗。最后,在3D打印制備的便攜式液滴PCR儀上進行PCR實驗。實現(xiàn)對細菌Lacz基因中100 bp片段的擴增,進一步實驗得出3D打印技術制備的便攜式液滴PCR儀靈敏度為1 ng/μL。對MCF-7乳腺癌細胞的miRNA-21進行擴增,驗證miRNA-21在便攜式液滴PCR儀上的擴增,并且筒式加熱器高溫區(qū)域溫度設置為105℃,低溫區(qū)域溫度設置為60℃時有最佳實驗結(jié)果。擴增MCF-10A正常細胞和MDA-MB-231乳腺癌細胞的miRNA-21,凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物,通過miRNA-21表達量的不同檢測出MDA-MB-231乳腺癌細胞。綜上所述,3D打印技術制備的便攜式液滴PCR儀成功實現(xiàn)了液滴PCR,并且檢測出癌癥細胞中的miRNA。不僅證明了3D打印技術制備PCR微流控芯片的可行性,并且實現(xiàn)了PCR儀的微型化。采用3D打印制備便攜式液滴PCR儀,還體現(xiàn)了3D打印技術的個性化制作、一體成型等優(yōu)勢。在下一步的研究中,我們將對實驗進一步的優(yōu)化,增加熒光檢測模塊實現(xiàn)實時檢測和分析實驗結(jié)果。同時,拓展PCR儀的應用場景,發(fā)揮它的巨大優(yōu)勢。相信在未來,3D打印技術制備的便攜式液滴PCR儀在生物醫(yī)學領域有廣泛的應用。
【學位單位】：西安電子科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TN492;TP391.73;R730.43
【部分圖文】：

脊椎動物、無脊椎動物和植物中進化保守，這說明它們。miRNA 由單個基因轉(zhuǎn)錄而成，存在基因之間或在蛋白顯子基因中[3]。miRNAs 在組織中特異性表達，組織中 疾病的狀況相關。成主要是前體 miRNA 的成熟、成熟 miRNA 組裝成微目標 mRNA 的翻譯來控制蛋白質(zhì)編碼基因的表達[4]，如iRNA通過RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄為較長的帶帽初級miRN內(nèi)切核糖核酸酶 III Drosha 酶和 DGCR8 在細胞核內(nèi)將 酸長的中間莖環(huán)結(jié)構前體 miRNA（pre-miRNA）[7]。Prtin-5 協(xié)助下從細胞核主動運輸?shù)郊毎|(zhì)，其次使用 RNr 蛋白，雙鏈反式激活響應 RNA 結(jié)合蛋白處理 pre-miR小雙鏈 RNA 結(jié)構[8][9]。雙鏈的 miRNA 被展開成為成熟NA 誘導的沉默復合物 RISC 上，復合物導入靶 miRNA13]，開放讀碼框架和啟動子區(qū)域[14]。

[29]。這些短 RNA 靶標擴增非常困難，微陣列特異性較低會導致假陽性。圖1.2 微陣列法檢測 miRNAs[29]另一方面，miRNA 的特性影響微陣列技術在 miRNA 表達分析中的應用。主要有四個原因：第一，miRNA 長度很短，為優(yōu)化雜交效率提供的序列很少；第二，GC 的含量差異很大，導致雜交的特異性有很大差異；第三，一些 miRNA 的豐度較低；第四，密切相關的 miRNA 家族成員甚至在單個核苷酸上也存在差異。為了解決這些問

圖1.3 PCR 法檢測 miRNA 原理[35][36]（a）polay（A）法（b）莖環(huán)法c. 液滴數(shù)字 PCRmiRNA 實現(xiàn)相對定量的主要問題在于缺乏通用和可靠的參考基因[37]。液滴數(shù)字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）使用液滴發(fā)生裝置，將 PCR 樣品分散到 2000個 nL 級別的液滴中。PCR 擴增在每個單獨的液滴中發(fā)生，并且里面的 PCR 實驗流程和基于 TaqMan 探針的實時 PCR 類型相似。當 PCR 擴增完成后，讀取液滴中 PC結(jié)果為陽性的部分。在泊松分布的假設下對參加反應的靶分子拷貝進行計算[38]，如圖1.4 所示。ddPCR 的優(yōu)點是絕對定量，不需要額外的內(nèi)參基因，檢測低豐度靶標的靈敏度更高，而且對擴增反應中抑制劑存在的耐受性有很大提升[39]。與 qRT-PCR 相比，ddPCR 在分析循環(huán) miRNA 方面的技術性能和診斷潛力均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[40]。
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本文編號：2884687