本文關(guān)鍵詞：卵泡抑素在納米二氧化硅誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用及機(jī)制研究

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【摘要】：伴隨納米二氧化硅(SiO2 NP)顆粒在工業(yè)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,其對人類健康的潛在危害越來越受人們關(guān)注。呼吸道是SiO2 NP主要暴露部位,因此SiO2 NP對呼吸系統(tǒng)的毒性作用得到廣泛研究。研究表明,SiO2 NP可引起呼吸道上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激。為應(yīng)對氧化應(yīng)激損傷,細(xì)胞主要通過活化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2從而促進(jìn)一些抗氧化基因、抗凋亡基因等的表達(dá)。然而,目前對SiO2 NP應(yīng)激蛋白及它們作用的認(rèn)識尚不全面。卵泡抑素(Follistatin, FST)為一分泌性蛋白,在細(xì)胞外結(jié)合TGF-p超家族成員而使其失活,從而參與了細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和分泌等多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。本課題組近來發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞應(yīng)激如糖剝奪、缺氧時可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)FST表達(dá),高表達(dá)的FST可發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)作用。然而FST是否響應(yīng)SiO2 NP刺激尚不清楚。為明確FST在SiO2 NP引起的細(xì)胞氧化損傷中的作用,我們首先研究了Si02NP暴露對FST表達(dá)的影響。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,SiO2 NP暴露1天、2天小鼠肺組織的FST mRNA水平顯著增加。蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組化結(jié)果也顯示,SiO2 NP暴露后1天、7天小鼠的肺組織FST蛋白水平均顯著增加。體外結(jié)果顯示,SiO2NP處理后,肺泡上皮細(xì)胞(A549)細(xì)胞中FSTmRNA和蛋白水平均顯著增加。以上結(jié)果表明,FST為一SiO2 NP響應(yīng)蛋白。FST mRNA水平的增加可能是其基因轉(zhuǎn)錄增加,也可能是其mRNA的降解減少。首先,我們利用放線菌素D抑制新mRNA的合成,隨后檢測剩余FST mRNA的半衰期。發(fā)現(xiàn)與對照組相比,SiO2 NP處理組FST mRNA降解速率并無改變,提示SiO2 NP并不影響FST的穩(wěn)定性。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,SiO2 NP處理后FST啟動子活性顯著升高；染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗結(jié)果表明,FST基因啟動子區(qū)的活性染色質(zhì)標(biāo)志物Ac-H3(K9/18)以及H3K4me2水平顯著增加,表明SiO2 NP可促進(jìn)FST基因轉(zhuǎn)錄。Nrf2是響應(yīng)氧化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄因子。為明確Nrf2在SiO2 NP促進(jìn)FST基因轉(zhuǎn)錄的作用,我們利用siRNA抑制細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)FST表達(dá)水平也顯著降低。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),FST啟動子區(qū)含有Nrf2的結(jié)合序列(ARE)。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,將Nrf2結(jié)合序列去除后,FST的轉(zhuǎn)錄不再受Nrf2表達(dá)水平的影響,表明Nrf2可通過ARE序列促進(jìn)FST的表達(dá)。最后,ChIP實驗結(jié)果顯示,Nrf2可與FST啟動子區(qū)結(jié)合,SiO2 NP處理顯著增加了Nrf2與FST啟動子的結(jié)合,表明Nrf2直接結(jié)合在FST啟動子區(qū)。以上結(jié)果表明,Nrf2直接結(jié)合在FST啟動子區(qū)的ARE序列上,從而促進(jìn)FST轉(zhuǎn)錄。為研究FST在SiO2N P誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的作用,我們抑制細(xì)胞內(nèi)FST表達(dá),隨后檢測細(xì)胞凋亡。對體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞進(jìn)行Annexin V染色發(fā)現(xiàn),SiO2 NP處理可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,利用siRNA抑制FST表達(dá)后細(xì)胞凋亡率顯著增加,表明FST可減少SiO2NP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。對小鼠肺組織進(jìn)行TUNNEL標(biāo)記發(fā)現(xiàn),SiO2 NP暴露可引起終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加,利用shRNA抑制FST表達(dá)后細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加。綜上所述,FST在體內(nèi)、體外均可減少SiO2 NP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。最后,我們研究了FST對細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響。發(fā)現(xiàn)SiO2(?) (?)P處理后,細(xì)胞內(nèi)總ROS水平顯著升高,抑制FST表達(dá)后ROS水平明顯高于對照組,而過表達(dá)FST組ROS水平顯著低于對照組。表明FST抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。進(jìn)一步,我們研究了FST對GAPDH氧化酶(NOX)家族成員表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,抑制FST表達(dá)后細(xì)胞NOX1和NX5的mRNA水平顯著性上調(diào),而過表達(dá)FST后細(xì)胞NOXl和NOX5的mriRNA水平顯著性下調(diào)。以上結(jié)果提示,FST通過抑制NOXl和NOX5的表達(dá)從而抑制SiO2NP誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。綜上所述,本學(xué)位論文的主要發(fā)現(xiàn)包括：1)SiO2NP誘導(dǎo)小鼠肺組織和培養(yǎng)的肺上皮細(xì)胞中FST的表達(dá)；2)SiO2NP通過調(diào)控Nrf2進(jìn)而活化FST基因；3)FST抑制SiO2NP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；4)FST抑制NOX1、NOX5基因表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。以上結(jié)果證明FST為一SiO2 NP應(yīng)激蛋白,在SiO2 NP引起的氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。這將有助于闡明SiO2 NP發(fā)揮毒性效應(yīng)的分子機(jī)制,并可能為針對SiO2 NP的防護(hù)提供可能靶點。
【關(guān)鍵詞】：SiO_2NP FST 轉(zhuǎn)錄 凋亡 ROS
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114;TB383.1
【目錄】：

• 致謝5-8
• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 縮略語表15-18
• 1. 引言18-24
• 1.1. 納米二氧化硅的毒理學(xué)研究18-21
• 1.2. 卵泡抑素及其生物學(xué)功能21-24
• 2. 材料和試劑24-31
• 2.1. 主要試劑24-26
• 2.2. 抗體26
• 2.3. 主要儀器設(shè)備及耗材26-28
• 2.4. 引物設(shè)計28-31
• 3. 實驗方法與原理31-47
• 4. 實驗結(jié)果47-61
• 4.1. SiO_2NP的表征47-49
• 4.2. SiO_2 NP促進(jìn)小鼠肺組織和人肺泡上皮細(xì)胞FST的表達(dá)49-52
• 4.3. SiO_2 NP促進(jìn)FST表達(dá)的分子機(jī)制52-56
• 4.4. FST抑制SiO_2NP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡56-58
• 4.5. FST抑制SiO_2 NP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激58-61
• 5. 討論61-66
• 6. 結(jié)論66-67
• 7. 參考文獻(xiàn)67-70
• 本學(xué)位論文創(chuàng)新點70-71
• 綜述71-80
• 參考文獻(xiàn)77-80
• 作者簡歷及科研成果80-81

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