背景蛋白質和核酸檢測對于病原感染、遺傳疾病、法醫(yī)分析和現(xiàn)代生命科學的發(fā)展至關重要。但是,生物分析往往目標物含量少、雜質多,因而開發(fā)新型的高靈敏檢測手段十分必要。納米材料具有獨特的光學性質和良好的生物相容性因而廣泛應用于生物分析中。核酸酶是能夠將核酸鏈的磷酸二酯鍵切斷的酶,常作為一種重要的工具用于生物分析中。本研究通過新型的納米材料核酸酶的DNA末端保護技術和信號放大技術構建了背景低、特異性好、靈敏度高的核酸與蛋白質檢測的新方法。目的（1）構建基于陽離子共軛聚合物和外切酶Ⅰ的熒光檢測方法用于蛋白質檢測及細胞成像,實現(xiàn)鏈霉親和素和葉酸受體的檢測以及HeLa熒光成像;（2）構建基于核酸外切酶Ⅲ及MoS₂納米片熒光猝滅性能的DNA雙重信號放大檢測方法,實現(xiàn)人血色素沉著癥基因的檢測。方法（1）鏈霉親和素（Strepavidin,SA）和生物素可以通過特異性結合,從而阻止探針核酸P1被核酸外切酶Ⅰ（Exonuclease Ⅰ,Exo Ⅰ）的消化,帶正電荷的陽離子熒光共軛聚合物（Polymer poly（9,9-bis（6’-N,N,Ntrimethylammonium）hex... 

【文章來源】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院河南省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

制備的PFP的FTIR光譜（A）和Zeta電位（B）

新鄉(xiāng)醫(yī)學院碩士學位論文9以具有較高熒光量子產率的PFP（Ex:370nm,Em:425nm）為能量供體。選擇最大吸收在490nm處，發(fā)射在530nm處的FAM標記P1為受體，因為其吸收與PFP的特征發(fā)射重疊（425nm，圖1.3）。在沒有SA的情況下，P1被ExoI從3’端依次消化水解成單核苷酸。而由于單核苷酸與PFP之間的靜電相互作用相對較弱，導致FAM遠離PFP，F(xiàn)RET很難發(fā)生。當SA存在時，SA和生物素的高度結合阻止了P1被ExoI消化，這是由于蛋白質-配體特異性相互作用產生了顯著的空間位阻。隨后，帶正電荷的PFP通過靜電相互作用靠近P1，使得從PFP到FAM發(fā)生FRET，在530nm處檢測到增強的熒光發(fā)射。因此，通過檢測FAM和PFP的FRET比值（I530/I425）來實現(xiàn)目標檢測。FRET比值與SA的濃度成正比。圖1.1制備的PFP的FTIR光譜（A）和Zeta電位（B）。Fig.1.1FTIRspectrum(A)andzetapotential(B)oftheas-preparedPFP.圖1.2基于陽離子共軛聚合物和外切酶I的蛋白質檢測原理圖。Fig.1.2SchematicdiagramofproteindetectionbasedoncationicconjugatedpolymerandExoI.

新鄉(xiāng)醫(yī)學院碩士學位論文10圖1.3PFP(abs,a;em,b)和P1(abs,c;em,d)的吸光度和熒光光譜。Fig.1.3AbsorbanceandfluorescencespectraofPFP(Abs,a;Em,b)andP1(Abs,c;Em,d).1.3.2方法的可行性分析首先通過凝膠電泳驗證SA對P1的末端保護。如圖1.4A所示，只有P1時有一個非常明顯的條帶（泳道1），在加入ExoI后（泳道2）條帶消失。這表明ExoI能夠有效地消化水解P1。在沒有ExoI的情況下，將P1與SA混合，觀察到兩個條帶發(fā)生不同的條帶遷移（泳道3），這歸因于P1和SA的結合。當P1與SA結合后加入ExoI時，仍然檢測到條帶遷移（泳道4）。這證明SA-P1復合物能保護P1使其免受ExoI消化。測量了不同條件下FRET的熒光強度，驗證了該方法的可行性。相應的熒光光譜如圖1.4B所示。在發(fā)射波長530nm、激發(fā)波長370nm處，P1表現(xiàn)出很弱的熒光強度（曲線a）。在P1溶液中加入PFP，在425nm處和530nm處可以明顯觀察到PFP和FAM的熒光信號（曲線b）。結果證實，P1通過強靜電力與PFP結合，并導致從PFP到FAM發(fā)生有效的FRET。然而，在加入PFP之前隨著ExoI和P1的混合，在沒有SA的情況下，530nm處的熒光強度顯著降低（曲線c）。這一現(xiàn)象表明ExoI催化消化P1產生單核苷酸，導致PFP和FAM之間的FRET效率低下。而P1與SA混合，然后加入ExoI和PFP，結果PFP在425nm處的熒光強度降低，530nm處熒光強度明顯增強（曲線d）。表明生物素與SA的特異性結合抑制ExoI消化P1并產生有效的FRET。上述結果表明，該方法可用于蛋白質分析。


本文編號：3535103