生物傳感技術(shù)是一門綜合了化學、信息學、生命科學等多種知識的交叉新興學科,因其具有成本低、選擇特異性、在線分析等眾多優(yōu)點,近年被廣泛應用于分析檢測、醫(yī)學診斷等領域。納米材料具有小尺寸效應、量子尺寸效應、表面效應、宏觀量子隧道效應一系列獨特性能,從而表現(xiàn)出異于常規(guī)材料的物理與化學性質(zhì),成為當下研究熱點。納米材料的出現(xiàn)及其優(yōu)良性質(zhì)為生物傳感的技術(shù)研發(fā)開辟了一條新思路,二者巧妙結(jié)合,有力地推動了化學分析、生命醫(yī)學與材料科學等多個領域的迅速發(fā)展。本論文基于熒光銅納米顆粒(CuNPs)與金屬有機框架材料(MOFs),構(gòu)建了三種響應速度快、分析成本低的新型熒光生物傳感器,成功實現(xiàn)了對鉀離子(K~+)、人類免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)寡核苷酸序列、三磷酸腺苷(ATP)的有效檢測。具體內(nèi)容如下:(1)第2章,基于核酸適配體與其目標物鉀離子之間的特異性識別,借助于核酸外切酶I(Exo I)和末端保護現(xiàn)象,通過熒光銅納米顆粒(CuNPs)的熒光信號強弱,構(gòu)建了一個免標記、高靈敏度的鉀離子傳感器。首先,設計了一條包含兩部分的單鏈DNA(ssDNA),其3’端為K~+核酸適配體序列,5’端為熒光銅納米顆粒的合成模板聚T序列(poly T)。當K~+與3’端核酸適配體相互識別時,會誘導其發(fā)生折疊進而形成G-四鏈體二級結(jié)構(gòu),該二級結(jié)構(gòu)能有效阻止Exo I對ssDNA從3’到5’端的水解,使得5’端poly T得以保留并為CuNPs的合成提供有效模板,體系可測到CuNPs的特征發(fā)射波長。當沒有K~+存在時,3’端K~+核酸適配體不會發(fā)生結(jié)構(gòu)變化形成G-四鏈體,3’末端沒有二級結(jié)構(gòu)保護,Exo I會將ssDNA水解成單個或很小的寡核苷酸碎片,因5’端poly T的合成模板被水解而無法合成CuNPs,體系熒光信號很低。該方法檢測限低,具有靈敏度高、特異性良好、低成本等優(yōu)點,可潛在應用于實際樣品檢測。(2)第3章,基于多孔型金屬有機框架材料(MOFs)對單、雙鏈DNA的吸附力顯著不同,設計了一個基于銅為金屬中心、均苯三甲酸為配體的金屬框架材料(Cu_3(BTC)_2)的新型熒光傳感器,用于檢測人類免疫缺陷病毒相關(guān)寡核苷酸序列,并探究了材料的降解性。由于π-π堆積,Cu_3(BTC)_2能特異性吸附ssDNA,并通過光誘導電子轉(zhuǎn)移(PET)效應猝滅ssDNA上標記的FAM熒光基團。當存在目標序列時,ssDNA雜交形成雙鏈DNA(dsDNA)時,Cu_3(BTC)_2對dsDNA吸附力較小,使得dsDNA與Cu_3(BTC)_2作用后不會附著在材料表面,FAM熒光信號不會被猝滅,基于此構(gòu)建了一個可快速有效檢測HIV相關(guān)寡核苷酸序列的熒光傳感平臺。實驗過程中還探究了材料Cu_3(BTC)_2的可降解性,利用氨基酸中羧基、氨基和Cu~(2+)的強配位能力,一定尺寸的氨基酸可通過MOFs表面的孔道進入材料內(nèi)部,充分破壞Cu_3(BTC)_2內(nèi)金屬原子與有機配體之間的配位作用,實現(xiàn)對材料的降解,使得原本被吸附在Cu_3(BTC)_2表面的ssDNA被釋放出來,被猝滅的FAM再度恢復熒光信號。該發(fā)現(xiàn)為快速檢測小尺寸氨基酸提供了潛在可能。(3)第4章,三磷酸腺苷(ATP)是生物體內(nèi)重要的能量儲存與轉(zhuǎn)換物質(zhì),被稱為能量傳遞的“分子貨幣”,同時也是S1核酸酶的抑制劑�；贏TP對S1核酸酶活性的抑制作用,結(jié)合S1核酸酶對ssDNA的特異性水解反應,我們利用CuNPs在602 nm處的熒光發(fā)射信號,發(fā)展了一種可特異性檢測ATP的免標記熒光傳感器。設計了一條由30個T堿基組成的ssDNA(T30),T30為CuNPs的有效合成模板,S1核酸酶會特異性水解ssDNA,使得CuNPs無法合成,體系熒光信號弱。當ATP存在,會抑制S1核酸酶活性,T30得以保留并為合成CuNPs提供模板,此時可檢測到CuNPs的較強發(fā)射信號。體系熒光信號強度與ATP濃度呈正比關(guān)系,線性范圍為0-0.2 mM。實驗表明該方法可成功應用于特異性檢測ATP,且無需熒光標記,DNA序列設計簡單,成本較低。
【學位單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TB383.1;TP212.3
【部分圖文】：

免標記雙波長發(fā)射的生物傳感器比率型檢測DNA的示意圖

如圖1.2 所示，設計了兩條分子信標（MB），MB1 和 MB2 其末端均修飾了巰基，利用 Au-S 鍵將 MB 固定于金納米顆粒（AuNP）表面，另一個末端則標記了熒光基團（MB1 標記的 Alexa Fluor 488，MB2 標記的 Cy3），此時兩條分子信標保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)，末端熒光基團離 AuNP 很近，AuNP 紫外吸收帶較寬

圖 1.3 基于 CuNPs 檢測肌動蛋白的熒光傳感器[52]）小分子的檢測Chen 等人[56]以 dsDNA-CuNPs 復合試劑為探針，結(jié)合 SYBR Green I 設計了檢測 H2O2的方法，該方法還能延伸到其他物質(zhì)檢測，如膽固醇，辣根過氧化
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本文編號：2855319