殼聚糖作為一種天然高分子材料,由于其優(yōu)異的生物相容性、生物降解性、抗菌性,以及促傷口愈合能力,被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的抗菌材料之一。然而,殼聚糖的水溶性差,只能在酸性條件下溶解并發(fā)揮抗菌作用,這極大的制約了其在生物體環(huán)境中的應(yīng)用。此外,殼聚糖的抗菌性能較弱,單一的殼聚糖材料較難滿足臨床上復(fù)雜的抗菌要求。因此,通常需要將殼聚糖與其他抗菌劑結(jié)合以增強(qiáng)其抗菌性能。在眾多抗菌劑中,納米銀由于具有廣譜的抗菌性且無(wú)耐藥性問(wèn)題,成為了研究最為深入、應(yīng)用最為廣泛的抗菌添加劑之一。但納米銀潛在的細(xì)胞毒性問(wèn)題也一直制約著其在生物體內(nèi)的應(yīng)用。本研究擬通過(guò)將生物相容性極佳的殼聚糖與抗菌性能極強(qiáng)的納米銀復(fù)合,制得兼具強(qiáng)效抗菌與生物無(wú)毒的新材料。具體研究成果如下:(1)通過(guò)酰胺化反應(yīng)將小分子鄰苯二酚接枝到殼聚糖分子上,制得了水溶性極佳的改性殼聚糖(CSS),解決了殼聚糖只能在酸性條件下發(fā)揮抗菌作用的問(wèn)題。利用鄰苯二酚的還原性以及殼聚糖的穩(wěn)定作用,將CSS作為還原劑和穩(wěn)定劑,可一步法制得了粒徑均一且穩(wěn)定性高的復(fù)合納米銀(CSS-AgNPs)。這種復(fù)合納米銀兼具了殼聚糖與納米銀的雙重優(yōu)點(diǎn):納米銀賦予了它突出的抗菌性能,而外層包裹的殼聚糖衍生物又使其細(xì)胞毒性顯著降低。細(xì)胞和細(xì)菌實(shí)驗(yàn)證明,CSS-AgNPs在適宜的劑量濃度下,可有效殺滅細(xì)菌而不對(duì)人體細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,有望被應(yīng)用于生物醫(yī)用領(lǐng)域。(2)針對(duì)納米銀和殼聚糖的抗菌機(jī)理仍不明確這一問(wèn)題,我們借助TEM和SEM等顯微成像技術(shù)和生化分析技術(shù),深入研究了革蘭氏陰陽(yáng)細(xì)菌被CSS-AgNPs作用后的微觀形態(tài)學(xué)變化,揭示了 CSS-AgNPs具體的抗菌作用機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn),CSS-AgNPs對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌性能明顯強(qiáng)于陽(yáng)性菌。這種特異性的抗菌作用與革蘭氏陰陽(yáng)兩種細(xì)菌不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)。CSS-AgNPs殺死陰性菌的關(guān)鍵在于破壞其致密且厚的細(xì)胞壁,而對(duì)細(xì)胞膜通透性的破壞是革蘭氏陰性菌被殺死的主要機(jī)理。(3)利用CSS-AgNPs表面的兒茶酚基團(tuán)與殼聚糖凝膠網(wǎng)絡(luò)中的氨基形成相互作用,可將CSS-AgNPs牢牢地固定在殼聚糖海綿的內(nèi)部以實(shí)現(xiàn)納米銀的緩釋。這種新型殼聚糖基載銀復(fù)合海綿具有優(yōu)異的長(zhǎng)效抑菌性能,可有效抑制革蘭氏陰陽(yáng)兩種細(xì)菌的增殖達(dá)到72h以上。同時(shí)殺菌性能顯著,有效殺菌率為99.99%。當(dāng)載銀量在0.63±0.09%時(shí),復(fù)合海綿既具有優(yōu)異的殺菌性能和長(zhǎng)效抑菌性能,細(xì)胞毒性也很低,是一種極具臨床應(yīng)用前景的抗菌敷料。(4)將帶負(fù)電荷的聚噁唑啉衍生物與帶正電荷的CSS-AgNPs進(jìn)行靜電自組裝,制得具有pH響應(yīng)性殺菌兼抗粘附性能的多層膜。我們合成了末端為甲氧羰基的噁唑啉單體,將其與末端為乙基的噁唑啉單體,按照一定的投料比聚合,制得了羧基單元比從高到低的三種聚噁唑啉衍生物。羧基的引入使本來(lái)不帶電的聚噁唑啉具有了電負(fù)性,電荷密度與羧基單元比含量成正比。研究發(fā)現(xiàn),該靜電自組裝中存在“臨界電荷密度效應(yīng)”。當(dāng)聚噁唑啉衍生物的電荷密度小于某臨界值時(shí),組裝無(wú)法連續(xù)進(jìn)行。而當(dāng)電荷密度超過(guò)臨界值時(shí),組裝可以順利進(jìn)行,且聚電解質(zhì)的吸附量隨電荷密度的降低而增大。該靜電自組裝多層膜呈指數(shù)型增長(zhǎng),這是弱聚電解質(zhì)在多層膜中“穿插滲透”導(dǎo)致的。接觸角實(shí)驗(yàn)表明,多層膜的最外層為聚噁唑啉衍生物時(shí)具有很好的親水性,有望在生物體內(nèi)發(fā)揮較好的抗細(xì)菌粘附效果。體外釋放測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明,該多層膜具有明顯的酸響應(yīng)釋放特性。環(huán)境pH的降低會(huì)使多層膜中聚噁唑啉上的羧基電離程度減小,其與CSS-AgNPs的作用力減弱,部分納米銀顆粒就會(huì)從多層膜中釋放出來(lái)。這一特性有望被應(yīng)用于刺激響應(yīng)性殺菌領(lǐng)域。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O636.1;TB33
【部分圖文】：

螯合以及絮凝作用，將殼聚糖用于工業(yè)廢水、生活污水的處理Ｕ１］。??１．２．２殼聚糖在生物醫(yī)用領(lǐng)域的應(yīng)用??除了較強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性外，殼聚糖還具有許多優(yōu)良的生物特性（見(jiàn)下圖１．２），具??體表現(xiàn)在以下幾方面（１）作為天然生物高分子，可生物降解，且降解產(chǎn)物無(wú)毒無(wú)??害，生物相容性好；（２）可與哺乳動(dòng)物和微生物細(xì)胞相結(jié)合；（３）促進(jìn)結(jié)締組織的再生，??加速傷口愈合；（４）促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，加速骨再生；（５）具有止血、抗菌、抗腫瘤??等作用。??２??

以促進(jìn)新生肉芽的形成和大量血管的再生，并具有一定的鎮(zhèn)痛作用［２２］。各類殼聚糖基??衍生物材料以膜、海綿、水凝膠等多種形式，作為傷口敷料申請(qǐng)專利保護(hù)并成功投放市??場(chǎng)，如３Ｍ公司研發(fā)生產(chǎn)的Ｔｅｇａｓｏｒｂ和Ｔｅｇａｄｅｒｍ?（詳見(jiàn)下圖１．３），以及美國(guó)ＩＭＳ公司??的?Ｃｈｉｔｏｄｉｎｅ?等［８］。??３Ｍ＇?Ｔ＾ａｄｅｒｍ＂?ａｎｄ?Ｔｅｇａｄｅｒｍ＂?ＨＰ??Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ?Ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ??Ｔｈｅ?ｃｌｅａｒ?ｃｈｏｉｃｅ?ｆｏｒ?ｅａｓｙ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｅｘｔｅｎｄｅｄ?ｗｅａｒ?ｔｉｍｅ??羽嫻＝??圖１．３左圖為殼聚糖基商用止血材料ＣＥＬＯＸ的產(chǎn)品外觀及使用場(chǎng)所示意圖，右圖為殼??聚糖基傷口敷料Ｔｅｇａｄｅｒｍ的產(chǎn)品外觀及適用部位示范圖。??１．２３殼聚糖基抗菌材料的研宄進(jìn)展??作為一種天然的中性高分子材料，殼聚糖由于其固有的抗菌性能和來(lái)源廣泛、產(chǎn)量??高等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最理想的抗菌材料之一，備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［９］。現(xiàn)階段，關(guān)于??殼聚糖抗菌作用的確切機(jī)制尚無(wú)定論，但現(xiàn)有的研究成果正在逐漸揭開(kāi)這一面紗，新的??猜想不斷被提出并在一定程度上得到了驗(yàn)證。??有研宄表明，帶正電荷的殼聚糖分子和帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜之間的相互作用會(huì)??導(dǎo)致細(xì)菌的生物膜發(fā)生破裂，隨后蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞內(nèi)成分會(huì)發(fā)生泄漏，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌??的死亡［ｉａ２３＿２６］。在較低濃度時(shí)，帶正電荷的殼聚糖與帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)??菌的聚集

液的抑菌作用具有濃度依賴性。并觀察到細(xì)胞膜對(duì)小分子細(xì)胞組分的通透性增強(qiáng)與顯著??的細(xì)胞膜去極化現(xiàn)象相伴而生。但沒(méi)有觀察到阻礙細(xì)胞壁生物合成的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步??觀察殼聚糖溶液的作用方式，掃描電鏡被用于觀察細(xì)胞的受損情況。結(jié)果如下圖１．４所??示，與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比（圖１．４ａ），經(jīng)殼聚糖溶液處理５分鐘后的葡萄球菌表面??就出現(xiàn)了不規(guī)則的突起物（圖１．４ｂ），這可能是帶正電荷的殼聚糖附著在了負(fù)電荷的細(xì)??菌表面。隨著殼聚糖溶液處理的時(shí)間延長(zhǎng)至２０分鐘（（圖１．４ｃ），細(xì)胞膜的局部開(kāi)始輕??微地剝離細(xì)胞壁，壁膜間形成了小“空泡樣”結(jié)構(gòu)。這可能是胞內(nèi)的離子和水發(fā)生了外??流，內(nèi)部壓力降低導(dǎo)致的。但是始終未曾觀察到細(xì)胞壁的破裂，細(xì)胞膜的物理結(jié)構(gòu)也保??持完整。轉(zhuǎn)錄響應(yīng)數(shù)據(jù)分析顯示，殼聚糖溶液處理后，金黃色葡萄球菌涉及調(diào)節(jié)應(yīng)激和??自溶的ＳＧ５１１基因的表達(dá)譜以及與能量代謝相關(guān)的基因發(fā)生了多重變化。因此研究人??員推測(cè)，殼聚糖與磷壁酸的結(jié)合加上膜脂質(zhì)（主要是脂磷壁酸）的潛在提取引發(fā)了一系??列事件
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