【摘要】：關(guān)節(jié)對(duì)于骨骼動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)機(jī)能至關(guān)重要,在活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,正常關(guān)節(jié)的骨軟骨組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯的梯度漸進(jìn)性和復(fù)雜的生理學(xué)特性。關(guān)節(jié)軟骨是包覆在關(guān)節(jié)面上的一層無(wú)血管、無(wú)神經(jīng)的含有少量細(xì)胞的終末端分化的多相結(jié)締組織。其中的細(xì)胞及膠原纖維等也存在復(fù)雜的梯度漸進(jìn)性。關(guān)節(jié)軟骨因在各種活動(dòng)中使用頻繁,極易導(dǎo)致病變及損傷。目前幾種修復(fù)手段的效果非常有限,因此,尋找創(chuàng)新性的修復(fù)方法是目前基礎(chǔ)科研及醫(yī)務(wù)工作者努力的方向。近幾年組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展為軟骨修復(fù)提供了新思路�，F(xiàn)有組織工程學(xué)研究大多著重于解決支架材料的生物相容性問(wèn)題,較少有兼顧構(gòu)建仿生骨軟骨梯度漸進(jìn)性的生理分層結(jié)構(gòu)與具有良好生物相容性的支架材料的研究。本論文以具有互補(bǔ)特性的天然材料殼聚糖(Chitosan,Cs)、β-甘油磷酸鈉(β-Sodium Glycerophosphate,GP)、明膠(Gelatin,Gel)為基礎(chǔ)原料,基于多元耦合仿生理念,協(xié)同發(fā)揮各原料的功能優(yōu)勢(shì),采用連通器型制備裝置形成孔道結(jié)構(gòu)的梯度漸進(jìn)性,通過(guò)調(diào)控原料配比來(lái)調(diào)節(jié)支架的孔徑,采用冷凍干燥技術(shù)致孔,首先制備了類(lèi)似軟骨天然構(gòu)造并具有良好生物相容性和可降解性的Cs/GP/Gel仿生軟骨梯度支架材料。結(jié)果表明,梯度支架材料擁有許多共性:優(yōu)異的三維多孔結(jié)構(gòu),孔徑介于20~180μm,孔道相互貫通,孔壁多褶皺,在高度方向上呈現(xiàn)出明顯的生理分層結(jié)構(gòu)和孔徑梯度漸進(jìn)性。隨著Cs的增加,梯度支架材料的孔徑逐漸增大,直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的較大孔徑,且梯度漸進(jìn)性越來(lái)越不明顯。而對(duì)照組支架的孔徑較均勻,未出現(xiàn)上述梯度現(xiàn)象,從側(cè)面證實(shí)了制備的梯度支架材料很好地模擬了真實(shí)軟骨的生理分層結(jié)構(gòu)。為制備與軟骨組織天然構(gòu)造和性能更加吻合且具有良好生物相容性和物化特性的支架材料,將納米羥基磷灰石(Nano-Hydroxyapatite,nHAp)復(fù)合在Cs/GP/Gel水凝膠中,進(jìn)行二次梯度構(gòu)建梯度支架材料(含鈣化層)。整體梯度支架材料上部仿生軟骨層很好地保持了Cs/GP/Gel梯度支架材料的良好孔道特征,說(shuō)明這種梯度漸進(jìn)性具有很好的可重復(fù)性;中部仿生軟骨鈣化層與上部仿生軟骨層銜接良好;底部仿生軟骨鈣化層的孔徑很小,可以有效阻隔兩側(cè)的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。為探究添加石墨烯(Graphene,Gr)對(duì)支架生物相容性的影響以及電磁刺激對(duì)支架中BMSCs的作用情況,將Gr摻雜進(jìn)Cs/GP/Gel水凝膠中,賦予其一定的電磁傳導(dǎo)功能,制備Cs/GP/Gel/Gr電磁支架材料。結(jié)果表明,支架微觀(guān)為優(yōu)異的三維多孔結(jié)構(gòu),孔壁呈灰黑色、多褶皺且觀(guān)察不到Gr片層,與對(duì)照組無(wú)異,吸水率、孔隙率分別介于250.28±13.16~424.27±19.32%、74.81±1.21~85.42±2.59%,相同測(cè)定條件下,略低于對(duì)照組,但其彈性模量普遍高于相同配比的對(duì)照組。Gr片層以納米尺度連續(xù)均勻地鑲嵌在支架孔壁上,不會(huì)改變支架本身的孔道分布,且對(duì)支架孔壁起到加固作用。為檢測(cè)制備的各支架的生物相容性及電磁刺激對(duì)支架中細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,將提取的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)以相同細(xì)胞密度接種于各支架上。(1)Cs/GP/Gel仿生軟骨梯度支架材料:支架上的細(xì)胞數(shù)量在孔徑的梯度方向上也呈現(xiàn)梯度排列,孔徑越小、孔道越連貫的區(qū)域存活的細(xì)胞密度越大。24 h時(shí)已有大量細(xì)胞黏附到支架孔壁上,突觸有開(kāi)始伸展的趨勢(shì),72 h時(shí)BMSCs已基本完全鋪展在支架表面。而相同配比的對(duì)照組支架未出現(xiàn)上述梯度現(xiàn)象,其上24 h時(shí)截留的細(xì)胞數(shù)目和72 h時(shí)細(xì)胞的鋪展?fàn)顟B(tài)等也明顯劣于梯度支架。因此,制備的具有仿生生理分層結(jié)構(gòu)的梯度支架材料生物相容性良好,更接近天然軟骨的真實(shí)構(gòu)造,更適合作為軟骨修復(fù)用仿生支架材料。(2)仿生軟骨梯度支架材料(含鈣化層):仿生鈣化層中細(xì)胞充分鋪展且已伸展進(jìn)支架內(nèi)部;仿生軟骨層的生物相容性有良好的可重復(fù)性,Cs/GP/Gel/nHAp支架模擬的鈣化層可有效銜接仿生軟骨層和仿生軟骨下骨層,起到良好的過(guò)渡、溝通和銜接作用。(3)Cs/GP/Gel/Gr電磁支架材料:摻雜Gr會(huì)增大支架的細(xì)胞黏附率。24 h時(shí)支架孔壁上及孔道內(nèi)已有大量細(xì)胞黏附且有開(kāi)始鋪展的趨勢(shì),72 h時(shí)BMSCs已基本完全鋪展在支架表面上,細(xì)胞間存在突觸連接。相同配比的對(duì)照組支架上截留的細(xì)胞數(shù)量明顯少且生長(zhǎng)進(jìn)程明顯慢。這說(shuō)明將適量Gr以納米尺度均勻鑲嵌在支架孔壁上能適當(dāng)調(diào)節(jié)其親疏水性能,同時(shí)增大其表面粗糙度,為細(xì)胞提供更大的鋪展面積和更多的附著位點(diǎn),加速細(xì)胞在其上生長(zhǎng)行為的進(jìn)行,并且滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)對(duì)電磁特性的要求。(4)BMSCs-Cs/GP/Gel/Gr電磁支架材料間歇電磁刺激:電磁刺激會(huì)增加BMSCs在支架上的黏附率,施加電磁刺激的電磁支架上的細(xì)胞黏附率增加為正常培養(yǎng)箱中的111.66%。電磁刺激環(huán)境下,Cs/GP/Gel/Gr電磁支架在24 h時(shí)出現(xiàn)許多已鋪展的細(xì)胞,比正常培養(yǎng)箱中的構(gòu)建體整合更快速,72 h時(shí)BMSCs充分鋪展在支架孔壁上,極少發(fā)現(xiàn)類(lèi)似正常培養(yǎng)箱中球形未鋪展的細(xì)胞。因此,適當(dāng)強(qiáng)度的電磁刺激有利于BMSCs在支架上的黏附生長(zhǎng)。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TB39

【參考文獻(xiàn)】

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1 寧平;陳明月;肖運(yùn)鶴;;淀粉填充改性PBAT的結(jié)構(gòu)與性能研究[J];化工新型材料;2010年07期

本文編號(hào)：2763188