【摘要】：角蛋白酶是一類可降解角蛋白的特殊蛋白酶,能作用于多種角蛋白底物,具有底物寬泛性,在醫(yī)藥、飼料、紡織等領域具有重要應用前景,其市場需求正在不斷提升。但目前多數(shù)角蛋白酶的酶活、應用性能等還無法滿足商業(yè)化應用要求,迫切需要挖掘更多優(yōu)質(zhì)角蛋白酶,并通過基因工程改造實現(xiàn)以角蛋白酶的高效表達及性能優(yōu)化。為此,本研究從角蛋白酶基因挖掘、高效表達、熱穩(wěn)定性改造及其在銀納米粒子制備中的應用研究等方面開展了一系列工作。主要研究內(nèi)容如下:(1)本論文首先從富含角蛋白的環(huán)境樣品宏基因組DNA中挖掘獲得一個角蛋白酶基因kerBv,該基因全長1149 bp,編碼382個氨基酸。先將該基因在大腸桿菌中進行異源表達,目的蛋白為胞內(nèi)酶,對宿主細胞傷害較大,非包涵體的活性表達酶活為40.9U/mL�？莶菅挎邨U菌具有優(yōu)秀的蛋白分泌能力,通過組裝信號肽成功實現(xiàn)了重組角蛋白酶的胞外分泌表達,發(fā)酵液中最高酶活為164.8 U/m L。酶學特性研究顯示,該角蛋白酶的最適反應溫度為60℃,最適反應pH為10.0,并具有水解多種角蛋白的底物寬泛性。(2)為繼續(xù)提升該重組角蛋白酶的表達水平和應用潛力,本研究采用啟動子工程和培養(yǎng)基優(yōu)化來實現(xiàn)枯草芽孢桿菌中重組角蛋白酶的高效表達。啟動子是影響目的基因表達的關鍵因素,選擇合適的啟動子有助于實現(xiàn)重組蛋白的高效表達。本論文成功構(gòu)建了攜帶16種不同啟動子序列的角蛋白酶重組菌,7株重組菌產(chǎn)酶水平顯著提升,其中PaprE啟動子適配性改造重組菌的酶活水平最高,達到2605 U/m L,是對照菌酶活的20倍。以添加15 g/L甘油的TB培養(yǎng)基進行5 L發(fā)酵罐產(chǎn)酶研究,結(jié)果顯示發(fā)酵至36 h時,發(fā)酵液中角蛋白酶活力高達7176 U/mL,是目前文獻報道的重組角蛋白酶表達的最高水平,為角蛋白酶的實際應用奠定了基礎。(3)角蛋白酶kerBv的熱穩(wěn)定性較差,其在60℃的半衰期為14.7 min。為提高重組角蛋白酶的熱穩(wěn)定性,利用理性設計策略尋找潛在的關鍵位點進行突變改造。構(gòu)建角蛋白酶三維同源模型,在模型上選取了高柔性Loop區(qū)域中8個位點進行定點突變改造研究。對各重組酶突變體進行熱穩(wěn)定性評估,結(jié)果顯示,N218S突變酶的熱穩(wěn)定性顯著提高,其在60℃的半衰期延長至50.6 min,為初始酶半衰期的3.4倍。(4)角蛋白酶kerBv表現(xiàn)出較強的還原力,該還原力源于對角蛋白中二硫鍵的還原作用。在前期改造的基礎上,本研究利用強還原力的角蛋白酶進行銀納米粒子的生物合成探究。經(jīng)制備條件的系統(tǒng)優(yōu)化,在1.0 mM AgNO_3濃度下,添加200 U角蛋白酶,反應48 h可制備出穩(wěn)定的銀納米顆粒。該銀納米粒子顆粒完整、粒徑范圍為3-15 nm,在420 nm處有特征吸收峰,Zeta電位值為-22 mV。抑菌結(jié)果顯示,100μg/m L銀納米粒子具有較好的抑菌活性。
【圖文】：

第一章 緒論第一章 緒論概述一種硬性纖維蛋白，在自然界中廣泛存在，具有不溶性、強抗的差異，角蛋白可分為 α-角蛋白和 β-角蛋白（圖 1-1）。羊毛、成，而羽毛則主要由 β-角蛋白構(gòu)成[1-3]。由于分子中存在大量，角蛋白不溶于水，化學性質(zhì)穩(wěn)定，很難被普通蛋白酶所降解

圖 1-2 不同角蛋白酶水解胰島素 B 鏈的切割位點Fig. 1-2 Cleavage sites of various keratinases as revealed by insulin B chain hydrolysis1.1.3 角蛋白酶的熱穩(wěn)定性研究角蛋白酶在實際應用中通常需要加熱來加速反應，且角蛋白酶粉制備時的噴霧干燥過程也需要加熱，因此，熱穩(wěn)定的角蛋白酶在實際應用中非常重要。提高酶熱穩(wěn)定性的方法包括添加保護劑、酶的化學修飾、固定化以及蛋白質(zhì)工程改造等[29]。圖 1-3 所示為提高酶熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程改造方法�；诘鞍踪|(zhì)三維結(jié)構(gòu)的定點突變改造是改變酶熱穩(wěn)定性的有效方法，近年來，建立在分子信息學基礎上的蛋白質(zhì)工程技術獲得了長足的發(fā)展，基于蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)或同源模型，利用計算機輔助設計能對角蛋白酶進行半理性或理性的蛋白質(zhì)工程改造，為提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性提供可行的技術手段。美國國立生物技術信息中心（NCBI）和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中存在角蛋白酶保守位點和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等信息，通過對信息的初步檢索、分析以及進行計算機預測，確定熱穩(wěn)定性改造的潛在位點，進而構(gòu)建突變體，進行體外實驗驗證，考察重組酶的表達情況及其熱穩(wěn)定性。對穩(wěn)定性提高的突變體進一步計算分析以闡明其熱穩(wěn)定性提高的分子機制[30]，如
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q55;TB383.1

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本文編號：2669867