【摘要】：即時診斷(Point-Of-Care Testing,POCT)首次出現(xiàn)于20世紀90年代,是屬于體外診斷器械的一個細分行業(yè)。由于其關注病人身邊的及時快速檢測,所以也常被稱為床旁檢測、分散檢驗、現(xiàn)場替代檢測等。2016年9月,Yole Développement公司在年度分析報告中,將“即時診斷”這個概念更新為“即時需求診斷(Point-of-Need Testing,PoNT)”。與即時診斷相比,即使需求診斷包含了更大的檢測范圍,除了人類疾病相關的檢測,也包括獸醫(yī)檢驗、工業(yè)檢驗(油、氣體以及化學品等)、農(nóng)業(yè)食品檢測(奶制品、食品、飲料、莊稼等)、環(huán)境監(jiān)測(水質監(jiān)控和細菌檢測等)和法醫(yī)學等領域。微流控(Microfluidics)技術是一種依托于現(xiàn)代微加工工藝,在微米尺度下的處理和操縱微流體的技術手段。這種技術可實現(xiàn)采樣、稀釋、加試劑、分離、檢測等實驗步驟并可將各種生化反應集成在幾平方厘米或更小的芯片上,從而減少樣品和試劑的消耗、提高檢測靈敏度、縮短反應時間并降低平均成本。微流控技術的核心是高度集成、微型化的芯片,該技術可滿足從生物小分子到細胞等不同尺度對象的檢測需求,并通過在后端耦合光、電、熱等形式的檢測器和讀數(shù)裝置,實現(xiàn)檢測流程的自動化和檢測結果的信息化�；谖⒘骺丶夹g的診斷儀器的微型化、集成化、自動化的特性,高度切合PoNT的發(fā)展需求,對優(yōu)化臨床檢測具有重要意義。近年來已日漸成為PoNT領域的研究熱點和核心技術。PCR芯片就是在這種趨勢下誕生的。PCR芯片不只是微流控芯片的一個應用,其樣本驅動、溫度控制和信號檢測等功能需要結合微機電系統(tǒng)(MEMS,MicroElectro-Mechanical System)的技術,尤其是在便攜式的PCR檢測設備中。本文探索了利用多壁碳納米管作為傳熱介質并結合紅外LED作為便攜式PCR儀加熱方式的可行性,開發(fā)了三套PCR平臺及其配套的微流控芯片與PCR產(chǎn)物檢測方法。在這三套平臺中,主要控制原理均是通過PID算法和脈沖寬度調(diào)制技術控制紅外LED的電壓信號從而調(diào)節(jié)紅外LED輸出功率的大小從而調(diào)節(jié)升溫的快慢,而降溫控制和PCR產(chǎn)物的檢測方式各不相同。在紅外激發(fā)的導熱油與碳納米管循環(huán)流動PCR平臺中(IR mediated Conducting Oil and CarbOn Nanotube circUlaTing PCR,IRCOCONUT PCR),我們設計了多層的微流控芯片,利用銅箔對導熱油層和PCR腔室層進行傳熱,降溫過程通過PID算法和脈沖寬度調(diào)制技術控制蠕動泵的轉速從而將芯片內(nèi)高溫的導熱油用油箱里低溫的導熱油取代實現(xiàn)降溫功能。在這部分試驗中,我們利用HPV 16型作為演示,對IR-COCONUT PCR平臺的性能進行了驗證。試驗表明,IRCOCONUT PCR平臺升溫速度可以達到1.5°C/s,降溫速度可以達到-2.0°C/s,與商用PCR儀性能相當。隨后,為了減少樣本測量中的人工操作,我們設計了與微流控芯片配套的緩沖液芯片、層流分析試紙條以及層流分析試紙條支架。最終,我們利用IR-COCONUT PCR平臺、微流控芯片和層流分析試紙條,在50分鐘之內(nèi)完成30個溫度循環(huán)并在25分鐘之內(nèi)實現(xiàn)目標產(chǎn)物的快速檢測。在第二個紅外PCR平臺中,我們利用了3D打印設計了底部有微腔室的微流控芯片,該芯片可以在一次進樣后將樣本分區(qū)并保證各分區(qū)間沒有交叉污染。同時,與IR-COCONUT平臺中的微流控芯片不同的是,在底部有微腔室的微流控芯片中,導熱油與樣本是直接接觸的。在與之配套的PCR平臺中,我們設計了用于熒光檢測的光路支架:支架上方為紅外LED,用于對主通道中的導熱油與碳納米管進行加熱,支架下方為藍光LED、濾光片以及CCD攝像頭,用于對PCR產(chǎn)物的熒光信號進行檢測,支架側方為USB風扇,通過PID算法和脈沖寬度調(diào)制技術控制風扇的轉速從而對芯片進行對流降溫。隨后,我們利用Ansys對微腔室的結構尺寸以及傳熱進行了仿真模擬并優(yōu)化了微流控芯片的設計。該紅外PCR平臺和PDMS微流控芯片升溫速度可以達到2.5°C/s,降溫速度為-0.9°C/s,可在90分鐘內(nèi)完成40個循環(huán)。通過CCD攝像頭在每個循環(huán)延伸結束時采集熒光照片,隨后通過軟件去掉背景光等干擾,可以成功檢測病人HPV 3種亞型的感染情況。最后我們開發(fā)了紅外激發(fā)的RNA恒溫擴增PCR平臺(IR MEdiated RNA Isothermal RT-PCR,IR-MERIT PCR),該平臺主要由三個模塊組成:溫度控制模塊、熒光檢測模塊和定位模塊。由于該平臺用于恒溫擴增,因此只需利用PID算法和PWM信號控制紅外LED即可實現(xiàn)控溫功能,而不再需要實現(xiàn)降溫功能的硬件。我們利用3D打印制作了定位模塊的主要部件,可靈活得實現(xiàn)多腔室熒光信號的采集。我們還利用圖案化的材料制作了具有三維通道結構的微流控芯片,這種制作方式更便于集成微泵、微混合器以及微閥等功能。最后,我們利用IR-MERIT PCR、微流控芯片以及光電二極管實現(xiàn)了沙眼衣原體、解脲脲原體以及生殖支原體三種疾病的同時檢測。我們設計的三套PCR平臺及其配套的微流控芯片展示了其在現(xiàn)場和即時需求診斷領域對基因或傳染病的快速檢測能力,對設計、制作小型化的便攜檢測儀器提供了技術方案。
【圖文】：

上海交通大學博士學位論文獻報道用粗血清實現(xiàn)實時 PCR 或者用預加熱處理的血液直接實現(xiàn) LAMP 恒溫擴增[65]。然而對于大多數(shù)情況，樣本的前處理是必需的，而且對紙基微流控來說也是一項挑戰(zhàn)[66]。有些樣本預處理是在芯片外部實現(xiàn)的，，如利用自動或手動的非便攜設備實現(xiàn)痰液[67]、唾液[68]、糞便[69]或尿液[70]的處理，這也是目前大多數(shù)商用 POCT 設備的現(xiàn)狀，所幸的這個現(xiàn)狀正在眾多研究人員的努力下漸漸改變[70-73]。由于樣本的來源有多種可能性，因此樣本的動力黏度也是在一個較大的范圍內(nèi)波動，大約為 1×10-3到 30Pa·s[74-76]。根據(jù) Lucas-Washburn 定律，流速與粘度平方的倒數(shù)成反比，這會限制有些樣本的移動距離小到只有幾個毫米。而實際中很多作者找到了相應的解決辦法。在實際樣本中，尿液（動力黏度約為 8mPa·s）是不需要考慮黏性因素的[77]。尿液分析試紙[78]、驗孕棒[79]和一些早期層流分析紙[80]是直接用紙吸取尿液樣本的，但對于一些傳染性疾病，尿液是否是一個合適的樣本是有爭議性的[81]，比如尿液成分僅能對 HIV 感染者進行結核檢測。唾液（動力黏度約為 8mPa·s[82]）也是可以不用稀釋直接處理的樣本。唾液大概能在紙基微流控通道中流過 2cm 的距離，所以也有研究者為了使之流經(jīng)更長的距離而在實際分析中引入了稀釋的步驟[83]。唾液的稀釋是通過搭接試紙條實現(xiàn)的，而且稀釋的比例也是可調(diào)的[84]。值得注意的是，近年來有很多檢測 HIV、丙型肝炎和 HPV 的病原都是采用的唾液樣本做的[85]。盡管精液黏度比較大[86]，但不用稀釋也是可以直接用紙基檢測的；而目前基于紙基的檢測還沒有直接用痰液（動力黏度約為 20-70mPa·s[87]）作樣本的。

上海交通大學博士學位論文1.4.2 全血過濾血液是非常重要的一種復雜樣本，其是有紅細胞、白細胞、血小板、外泌體和其他一些生物分子等組成。由于其成分的復雜性，因此多數(shù)情況下必須經(jīng)過過濾，避免其中的一些成分干擾擴增。而目前基于尺寸排阻的層析法可以成功移除免疫球蛋白 G、血紅蛋白（紅細胞中）和乳鐵蛋白[89]（白細胞中）等對 PCR 擴增有顯著抑制作用的成分。紙的多孔微結構和其具有的毛細作用力可以自發(fā)的根據(jù)尺寸過濾紅細胞，再結合有些抗體可以促使紅細胞團聚，因此利用這個特性直接從血液中提取血漿。血和紙在醫(yī)院婦產(chǎn)科中被用作新生兒血型化驗已經(jīng)有幾十年的歷史了[90]：格思里氏試驗卡可以用作儲存指尖血血跡，而干血跡可以保存數(shù)天到數(shù)月而不失效。在核酸擴增檢測領域，干血跡主要用來做 HIV 的檢測[91, 92]，其他疾病[93]如血紅蛋白病、Duchenne 型肌營養(yǎng)不良和囊性纖維化也要報道。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TH77;TB383.1

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本文編號：2661860