【摘要】：酶催化在有機合成中是一種有效且綠色的生物轉(zhuǎn)化手段,但是由于酶穩(wěn)定性差,不易分離(即難回收),這限制了其在合成中更進一步的發(fā)展。酶固定化技術(shù)正好在穩(wěn)定性、可回收利用等方面具有優(yōu)勢,但是傳統(tǒng)的固定化酶普遍有活性降低的缺點,這在一定程度上限制了它在工業(yè)上的應用。而如今出現(xiàn)了一種既簡單又有效的固定化技術(shù),即酶-無機物晶體復合納米花的制備。酶晶體中的酶活性中心通過無機載體限制在特定的空間,具有細胞環(huán)境類似的限域效應。本文在制備無機物-酶晶體的基礎上,利用酶晶體具有限域催化的優(yōu)點,將其應用在有機合成中,并讓無機金屬鹽同時作為載體和助催化劑成為可能。本論文采用酶-無機物共結(jié)晶方法,制備出木瓜蛋白酶-磷酸銅晶體復合納米花,并用于混亂催化Knoevenagel縮合反應。酶晶體首先通過混合的硫酸銅水溶液和在磷酸鹽緩沖液中的酶在室溫下制備而成。得到的酶晶體通過SEM表征,且其活力通過N-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基酰胺鹽酸鹽作為底物的水解反應來檢測。分析結(jié)果顯示磷酸銅酶晶體的負載率為94.5%,在最適條件下該酶晶體的水解活性是游離酶的15倍,且有很好的熱穩(wěn)定性。選取了一系列的條件(反應溫度,時間和溶劑)研究并考查其對縮合反應產(chǎn)物產(chǎn)率的影響。在最適條件下,當苯甲醛和乙酰丙酮作為底物時,酶晶體催化得到的產(chǎn)率是游離酶催化的1.25倍。同時結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶晶體在循環(huán)催化72 h后仍保持初始活性的87.8%,同時與游離酶相比,其穩(wěn)定性也大大提高。而當進一步進行底物拓展時,大部分結(jié)果表示酶晶體的催化活性比游離酶好。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)當其余反應條件相同時,不飽和醛上的取代基為強吸電子基團時比強供電子基團具有更好的產(chǎn)率,同時推測銅離子可能有降低不飽和醛上電子云密度的作用,促進碳碳鍵的生成。鑒于銅離子重金屬離子的毒性會對人體和環(huán)境造成危害,不適合用于藥物合成中,故選用鈣離子來代替銅離子制得酶-磷酸鈣復合納米花。本文選擇了6種酶(包括木瓜蛋白酶,菠蘿蛋白酶,胰蛋白酶,疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶-TLL,南極假絲酵母脂肪酶B-CALB,胰蛋白酶-PPL)來制備酶-無機物酶晶體復合納米花。得到的酶晶體的負載率都在95%左右,且都比游離酶表現(xiàn)出更好的活性和熱穩(wěn)定性。使用過的酶晶體可通過加入磷酸來溶解納米花,并通過加熱使蛋白變性分離,從而回收納米花中的磷酸鈣、磷酸氫二鈣和磷酸二氫鈣。通過重量檢測,發(fā)現(xiàn)磷酸鈣的回收率都在95%以上。此外,用回收的磷酸鹽制備的酶晶體活性幾乎不變。酶被磷酸鈣限定在特定的空間,形成限域空間,酶與底物在特定的空間內(nèi)能夠更有效地結(jié)合,促進反應速率。將其中TLL制備得到的磷酸鈣酶晶體用于催化克林霉素棕櫚酸酯的合成中。其水解活性在最適條件下是游離酶的8.2倍且有較好的熱穩(wěn)定性。本文利用骨頭中含有的大量磷酸鈣,將其作為無機成分制備得到TLL酶晶體,其被稱為天然源TLL酶晶體,其酶活是游離酶的8.9倍。在以石油醚為溶劑的條件下,酶晶體能催化得到69.6%的產(chǎn)率,游離酶能得到79.1%的產(chǎn)率。雖然游離酶催化的產(chǎn)率比酶晶體好,但是酶晶體可以進行循環(huán)催化,且催化活性在循環(huán)10次后(12 h/次)仍舊保持在90%以上。在酶晶體催化合成維生素A棕櫚酸酯中,在最適條件下,酶晶體催化能夠得到90.39%的產(chǎn)率,而游離酶催化只能得到61.31%的產(chǎn)率,且酶晶體循環(huán)催化10次(12 h/次)后還有73.2%的相對產(chǎn)率�？傊�,在本文中通過酶-無機物共結(jié)晶的方法制備了酶-無機物復合納米花,實現(xiàn)了酶蛋白的簡易固定化。無機物晶體的包埋使得酶蛋白在催化中呈現(xiàn)出一定的限域效應,以致酶蛋白穩(wěn)定性和活性得以大幅提高。同時,在酶-磷酸鈣復合納米花的進一步研究中,通過磷酸鈣結(jié)晶、酸解和再結(jié)晶方法,可回收和重復使用納米花中的無機組分磷酸鈣,從而實現(xiàn)酶和無機載體的雙循環(huán),避免了固定化酶過程中金屬離子污染、載體難回收問題。而將酶-磷酸鈣晶體復合納米花用于棕櫚酸酯類藥物合成中,以其高活性、高穩(wěn)定性及多次循環(huán)利用可有效降低相應藥物的制備成本,因此酶-無機物晶體復合納米花固定化方法可進一步豐富和推動酶固定化和催化理論與應用研究的發(fā)展。
【圖文】：

傳統(tǒng)的固定化方法，，（1）物理吸附法；（2）共價法；（3）交聯(lián)法；（4）-（6）

克林霉素棕櫚酸酯的合成[62]
【學位授予單位】：杭州師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O643.36;TB383.1

【參考文獻】

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本文編號：2606717