【摘要】：適配體是通過SELEX技術(shù)篩選得到的單鏈寡核苷酸,因其所具有的種種性質(zhì),如高穩(wěn)定性,易合成以及能高特異性地結(jié)合多種目標(biāo)分子(小分子,蛋白質(zhì)甚至是整個細(xì)胞)等,所以,適配體受到了越來越多的關(guān)注。因為納米材料具有的獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、催化特性的性質(zhì),使得它能夠和生物分子相互作用,進(jìn)而達(dá)到信號放大和目標(biāo)識別的目的。兩者結(jié)合起來所形成的適配體功能化納米粒子,在生物分析和醫(yī)療診斷方面具有廣泛的應(yīng)用前景。在本文中,我們基于銀納米粒子對熒光的猝滅作用設(shè)計了一種簡單且高靈敏的蛋白質(zhì)檢測分析方法。首先將修飾有熒光分子的適配體自組裝到銀納米粒子表面,合成了銀納米粒子探針。固定在96孔板中的適配體,和銀納米粒子探針分別作為捕獲單元和檢測探針,可以完成對加入的目標(biāo)蛋白PDGF-BB的特異性識別,三者形成三明治復(fù)合物。此時由于FRET(fluorescence resonance energy transfer,熒光共振能量轉(zhuǎn)移)效應(yīng),熒光基團(tuán)被銀納米粒子猝滅,信號處于“off”狀態(tài)。當(dāng)加入蝕刻劑硫代硫酸鈉后,銀納米粒子被溶解,FRET效應(yīng)被破壞,修飾在銀納米粒子表面的熒光分子便會脫離,并釋放到孔板中,信號"turn-on"。結(jié)果表明,目標(biāo)蛋白PDGF-BB的濃度與檢測到的熒光信號的強(qiáng)度呈正比。該方法可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的高靈敏和高特異性的檢測。此方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：三明治結(jié)構(gòu)能大大提高檢測的特異性和靈敏度；蝕刻劑的引入使信號從“off”變?yōu)椤皁n”。該方法還可以通過對適配體分子的合理設(shè)計,進(jìn)一步擴(kuò)展到其它蛋白或小分子的分析檢測中,在分析領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景�；诩{米金屬結(jié)構(gòu)的LSPR(localized surface plasmon resonance,局部表面等離子體共振)的金屬增強(qiáng)熒光(metal enhanced fluorescence, MEF)的發(fā)展,拓寬了熒光分析的應(yīng)用范圍。由于其獨(dú)特的表面等離子體共振特性,銀納米粒子能夠增強(qiáng)許多熒光分子信號,因此利用銀納米粒子的MEF效應(yīng),發(fā)展出很多應(yīng)用。在本文中,基于銀納米粒子的MEF效應(yīng)和FRET效應(yīng),我們建立一種小分子檢測分析方法。首先,我們將熒光分子自組裝至納米銀表面,然后在熒光分子外層包裹一層銀殼,實(shí)現(xiàn)對熒光分子的熒光增強(qiáng)效果。然后,通過核酸雜交的方式將淬滅分子BHQ修飾的適配體連接至銀殼上形成FRET傳感器。此時熒光分子的熒光信號猝滅。而當(dāng)加入目標(biāo)物腺苷后,由于適配體與腺苷的特異性結(jié)合,BHQ脫離銀殼表面,熒光信號得到恢復(fù)。實(shí)驗結(jié)果顯示,熒光的恢復(fù)程度與目標(biāo)物腺苷的濃度呈線性關(guān)系。該方法充分利用了銀納米粒子的特性,靈敏度高,特異性強(qiáng),且操作簡單,擁有很大的潛力。
[Abstract]:Aptamer is a single-stranded oligodeoxynucleotides screened by SELEX. Because of its various properties, such as high stability, easy synthesis and high specific binding to a variety of target molecules (small molecules, proteins and even whole cells), aptamers have received more and more attention. Because of its unique optical, electrical and catalytic properties, nanomaterials can interact with biomolecules, and then achieve the purpose of signal amplification and target recognition. The functional nanoparticles formed by the combination of the two have a wide range of application prospects in biological analysis and medical diagnosis. In this paper, we designed a simple and highly sensitive protein detection and analysis method based on the quenching effect of silver nanoparticles on fluorescence. Firstly, the aptamer modified with fluorescent molecules was self-assembled on the surface of silver nanoparticles, and the silver nanoparticles probe was synthesized. The adaptor fixed in 96 well plate and silver nanoparticles probe can be used as capture unit and detection probe, respectively, to complete the specific recognition of the added target protein PDGF-BB, and the three can form sandwich complex. At this time, due to the fluorescence resonance energy transfer effect of FRET (fluorescence resonance energy transfer, the fluorescence group is quenched by silver nanoparticles and the signal is in the "off" state. When the etch agent sodium thiosulfate is added, the silver nanoparticles are dissolved and the FRET effect is destroyed. the fluorescent molecules modified on the surface of the silver nanoparticles will be detached and released into the pore plate, and the signal "turn-on" will be released. The results showed that the concentration of the target protein PDGF-BB was proportional to the intensity of the detected fluorescence signal. This method can be used to detect the target protein with high sensitivity and specificity. This method has the following advantages: sandwich structure can greatly improve the specificity and sensitivity of detection, and the introduction of etch agent can change the signal from "off" to "on". This method can also be further extended to the analysis and detection of other proteins or small molecules through the reasonable design of aptamer molecules, and has a good application prospect in the field of analysis. The development of metal enhanced fluorescence (metal enhanced fluorescence, MEF) based on local surface plasmon resonance (LSPR (localized surface plasmon resonance,) with nano-metal structure broadens the application range of fluorescence analysis. Because of its unique surface plasmon resonance characteristics, silver nanoparticles can enhance many fluorescent molecular signals, so many applications have been developed by using the MEF effect of silver nanoparticles. In this paper, based on the MEF effect and FRET effect of silver nanoparticles, we establish a small molecular detection and analysis method. First of all, we self-assemble the fluorescent molecules to the surface of nano-silver, and then wrap a layer of silver shell in the outer layer of the fluorescent molecules to achieve the fluorescence enhancement effect of the fluorescent molecules. Then, the quenched molecular BHQ modified aptamers were connected to the silver shell to form a FRET sensor by nucleic acid hybridization. At this time, the fluorescence signal quenching of fluorescent molecules. When the target adenosine was added, the fluorescence signal of BHQ was recovered because of the specific binding of aptamer to adenosine. The experimental results show that there is a linear relationship between the recovery degree of fluorescence and the concentration of adenosine. This method makes full use of the characteristics of silver nanoparticles, has high sensitivity, strong specificity, simple operation and great potential.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TB383.1;O614.122

【共引文獻(xiàn)】

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