本文關(guān)鍵詞：花狀納米金及抗獨(dú)特型納米抗體在真菌毒素免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用研究　出處：《南昌大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：真菌毒素為產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物,廣泛存在于自然界,可經(jīng)由污染的農(nóng)產(chǎn)品和食品對(duì)人畜的健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致癌癥甚至喪命,其中尤以黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB!)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin,OTA)毒性較大,因此建立快速、靈敏且特異性的檢測(cè)方法顯得尤為重要。在檢測(cè)方法中,免疫學(xué)檢測(cè)方法因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)且簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)是目前常用的真菌毒素檢測(cè)方法,但隨著我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品及食品進(jìn)出口貿(mào)易的增加,人們對(duì)其質(zhì)量和安全的要求愈來(lái)愈高,普通的免疫學(xué)檢測(cè)方法已經(jīng)難以滿(mǎn)足人們對(duì)真菌毒素高靈敏性和特異性的要求,因此建立高靈敏和高特異性的真菌毒素免疫學(xué)檢測(cè)方法勢(shì)在必行。本論文以建立高靈敏性和特異性的免疫學(xué)分析方法為目的,從檢測(cè)信號(hào)及免疫學(xué)識(shí)別元件兩個(gè)方面對(duì)AFB1和OTA進(jìn)行新型分析方法的研究。首先合成了具有高光學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性的花狀納米金(Gold nanoflowers,AuNFs),以其作為新型標(biāo)記探針,建立了AFB1高靈敏的免疫層析檢測(cè)技術(shù);同時(shí),從羊駝天然納米抗體文庫(kù)中淘選得到OTA抗獨(dú)特型納米抗體(anti-idiotypic nanobody,AId-Nb),以其取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成抗原,建立了高靈敏的環(huán)境友好型OTA分析方法。主要研究?jī)?nèi)容包括:1以對(duì)苯二酚作為還原劑,通過(guò)種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法,合成高質(zhì)量的AuNSs和AuNFs。通過(guò)改變種子、氯金酸及對(duì)苯二酚的添加量,對(duì)AuNSs和AuNFs的合成條件進(jìn)行初步探索,并通過(guò)透射電子顯微鏡、紫外-可見(jiàn)光-近紅外分光光度儀和Zeta電位等表征手段對(duì)納米金的形貌、光學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性進(jìn)行表征。結(jié)果顯示,種子的添加量為影響粒徑大小的主要因素,即隨著種子添加量的減少,納米金的粒徑顯著增大,并且表面粗糙程度增加,可逐漸形成AuNFs,當(dāng)種子的加入體積≤500μL時(shí)生成AuNFs;反應(yīng)速率為影響形貌的主要因素,即降低氯金酸添加量(≤150μL)或增加對(duì)苯二酚添加量(3000μL≤V≤4000μL)均可生成AuNFs。75nm AuNFs的吸光度是75nm AuNSs的吸光度的1.5倍,表明相同粒徑的AuNFs不僅具有更強(qiáng)的光學(xué)特性,而且穩(wěn)定。2以AuNFs作為新型標(biāo)記探針,建立AFBi的免疫層析試紙條定量檢測(cè)方法。通過(guò)抗AFB1單克隆抗體與AuNFs偶聯(lián),以檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))吸光值與質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))吸光值的比值(ODT/ODC)進(jìn)行定量。對(duì)大米樣品進(jìn)行檢測(cè),并與傳統(tǒng)ELISA方法進(jìn)行結(jié)果對(duì)比。結(jié)果顯示,當(dāng)AFBi濃度在0.5～25 pg/mL范圍內(nèi),具有較好的線(xiàn)性,且50%抑制濃度(IC50)達(dá)到4.17pg/mL(n=5),最低檢測(cè)限為0.32pg/mL,較傳統(tǒng)的AuNSs試紙條的靈敏度提高了 10倍。批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于15%。采用該試紙條和商業(yè)化ELISA試劑盒分別分析50份陰性加標(biāo)大米樣品,兩者的結(jié)果具有較好的線(xiàn)性相關(guān)性(R2=0.93)。以AuNFs作為標(biāo)記探針建立免疫層析檢測(cè)方法,具有較好的靈敏度,且具有較廣闊的商業(yè)化應(yīng)用前景。3以抗OTA單克隆抗體為靶分子,采用“1輪酸洗脫+3輪競(jìng)爭(zhēng)洗脫”的策略,從羊駝天然納米抗體噬菌體文庫(kù)中親和淘選與之結(jié)合的AId-Nb噬菌體,并建立實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR(Q-IPCR)。經(jīng)淘選得到一株OTA-AId-Nb噬菌體克隆,并基于該噬菌體建立了 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),IC50為300pg/mL,靈敏度較基于傳統(tǒng)化學(xué)合成抗原的ELISA提高了 8.83倍。進(jìn)一步構(gòu)建Q-IPCR,其最低檢測(cè)限為4.17 pg/mL,比以噬菌體構(gòu)建的ELISA方法靈敏度提高了 9倍。實(shí)際谷物中的Q-IPCR檢測(cè)結(jié)果與商業(yè)化ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果具有較好的相關(guān)性�；贏Id-Nb的環(huán)境友好型的Q-IPCR檢測(cè)方法為小分子有毒有害污染物的檢測(cè)提供了新的方法。4以O(shè)TA-AId-Nb噬菌體特異性基因構(gòu)建重組表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta(DE3)中表達(dá)。以O(shè)TA-AId-Nb取代化學(xué)合成抗原,建立了環(huán)境友好型ELISA及免疫層析試紙條法。將OTA-AId-Nb作為包被抗原建立ELISA,線(xiàn)性范圍為0.08-1.0 ng/mL,IC50為0.25 ng/mL,靈敏度較以化學(xué)合成抗原建立的ELISA提高了 10倍。與其它四種真菌毒素(DON、AFBi、FB1、ZEN)無(wú)交叉反應(yīng)。以此OTA-AId-Nb取代傳統(tǒng)化學(xué)合成抗原,以AuNFs作為標(biāo)記探針,建立免疫層析檢測(cè)方法,其cut off值為4 ng/mL,可實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好型現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[Abstract]:A class of secondary metabolites for toxigenic fungi produce mycotoxins, widely exists in the nature, cause serious harm through pollution of agricultural products and food for human and animal health, serious when can cause cancer or even killed, especially in aflatoxin B1 (Aflatoxin B1, AFB!) and ochratoxin A (Ochratoxin OTA), toxicity, so establishing a rapid, sensitive and specific detection method is particularly important. In the detection method, immunological detection methods with high sensitivity, specificity and simple and convenient is a mycotoxin detection method used commonly, but with the increase of China's agricultural products and food import and export trade. The quality and safety of the increasingly high demand, the general immunological detection methods have been difficult to meet the demand of mycotoxins in high sensitivity and specificity, so the establishment of high sensitivity and high specificity It is imperative to mycotoxin immunological detection methods of this paper. For the purpose of establishing immunological analysis method with high sensitivity and specificity, from the two aspects of signal detection and immunological recognition element model analysis method of AFB1 and OTA. The first synthesis of flower like nano gold high optical properties and stability of the Gold (nanoflowers AuNFs), as the new probe labeled an immune chromatography AFB1 high sensitive detection technology; at the same time, from the alpaca natural nano antibody library binding in OTA anti idiotypic antibody (anti-idiotypic nanobody, AId-Nb nano), to replace the traditional chemical synthesis of antigen, the establishment of environmental friendly high sensitive OTA analysis methods. The main research contents include: 1 using hydroquinone as a reducing agent, through seed mediated growth method, synthesis of high quality AuNSs and AuNFs. through the change of seed, gold chloride Adding acid and hydroquinone, explores the synthesis conditions of AuNSs and AuNFs, and by transmission electron microscopy, morphology of gold nanoparticles of ultraviolet visible near infrared spectrophotometer and Zeta potential characterization, optical properties and stability were investigated. The results showed that the adding amount of seeds as the main factors affecting the particle size is decreased with seed addition amount, nano gold particle size increased significantly, and the increase in surface roughness, can be gradually formed when adding AuNFs, seed volume less than or equal to 500 mu L generated AuNFs; the reaction rate for the main factors affecting the morphology, namely reducing chloroauric acid added amount (less than or equal to 150 mu L) or increase the amount of hydroquinone (3000 L = V = 4000 L) can generate AuNFs.75nm AuNFs absorbance is 1.5 times the absorbance of 75Nm AuNSs, showed that the optical properties of the same size AuNFs not only has stronger, and Stable.2 to AuNFs as a new probe labeled immunochromatographic quantitative detection method of the AFBi is established. Through the coupling of anti AFB1 monoclonal antibody and AuNFs to detect line (T line) absorption value and control line (C line) absorption ratio of light value (ODT/ODC) was used for quantitative analysis. To detect the rice samples, and the results were compared with the traditional ELISA method. The results showed that when the concentration of AFBi in 0.5 ~ 25 pg/mL range, good linearity, and the 50% inhibitory concentration (IC50) to 4.17pg/mL (n=5), the lowest detection limit was 0.32pg/mL, compared with the traditional AuNSs test strip sensitivity was 10 times higher than in batch and. Interassay coefficient of variation was less than 15%. by using the test strip and commercial ELISA kit respectively analyzed 50 negative samples spiked rice samples, the result is a good linear correlation (R2=0.93). Using AuNFs as the labeled probe to establish immune chromatography detection method, has better The sensitivity, and has a broad application prospect in commercialization of.3 anti OTA monoclonal antibody as a target molecule, the 1 round +3 round of competition acid elution elution "strategy, from the alpaca natural nano antibody phage library affinity with AId-Nb phage panning, and establish a real-time fluorescence quantitative immuno PCR (Q-IPCR). Strains of OTA-AId-Nb phage clones obtained by phage panning, and based on the established standard curve of ELISA, IC50 for 300pg/mL, the sensitivity is based on the traditional chemical synthesis of antigen ELISA increased 8.83 times. Further construction of Q-IPCR, the lowest detection limit was 4.17 pg/mL, than the ELISA method to construct the phage sensitivity was 9 times higher than Q-IPCR detection. The actual results in grain and commercial ELISA kit test results have good correlation. Environment friendly AId-Nb Q-IPCR detection method based on small molecules for toxic pollutants The test provides a new method of.4 expression vector and transformed into E.coli Rosetta OTA-AId-Nb to construct the recombinant phage specific gene (DE3) expression. To replace the chemical synthesis of antigen to OTA-AId-Nb, the establishment of environmental friendly ELISA and immunochromatographic method. OTA-AId-Nb was used as coating antigen to establish ELISA, linear range is 0.08-1.0 ng/mL, IC50 0.25 ng/mL, the sensitivity is based on the chemical synthesis of the antigen ELISA increased 10 times. And the other four kinds of mycotoxins (DON, AFBi, FB1, ZEN). No cross reaction to OTA-AId-Nb to replace the traditional chemical synthetic antigen, using AuNFs as a probe labeled immunochromatographic method was developed by the cut, off value 4 ng/mL, which can realize rapid detection of environment friendly site.

【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：TS207.5;TB383.1

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本文編號(hào)：1399437