【摘要】：研究背景：隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,生活水平的提高、環(huán)境和習(xí)慣的改變,我國乃至全球肥胖癥患病人數(shù)逐漸增多,1980年以來,世界肥胖人數(shù)增長了近一倍,至2008年,20歲及以上的成年人中有超過14億人超重,其中2億多男性和近3億女性為肥胖癥患者,肥胖正威脅著越來越多的人的健康：超重和肥胖是全球引起死亡的第六大風(fēng)險,許多疾病都與肥胖有著密切的關(guān)系：如糖尿病、高脂血癥、高血壓病、冠心病及某些腫瘤如乳腺癌、直腸癌等。肥胖及其所帶來的健康問題為全球各個國家的經(jīng)濟(jì)增加了沉重的負(fù)擔(dān)。在成人,肥胖的病理生理主要是指脂肪細(xì)胞體積的增大,即細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的增加,其原因包括甘油三酯合成的增加和/或者分解的減少。在本研究中,我們重點(diǎn)關(guān)注了脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的分解代謝(即脂解)。脂解是指甘油三酯逐步分解為游離脂肪酸和甘油的過程,這一過程受很多酶和因子的調(diào)控。曾經(jīng),人們認(rèn)為激素敏感性脂肪酶(HSL)是甘油三酯分解過程中的唯一限速酶,直到脂肪甘油三酯脂酶(Adipose Triglyceride Lipase, ATGL)被人們發(fā)現(xiàn)。ATGL于2004年被發(fā)現(xiàn),隨后的研究發(fā)現(xiàn),它是脂解過程中的一種重要的限速酶：ATGL負(fù)責(zé)將甘油三酯分解為甘油二酯和游離脂肪酸,啟動了甘油三酯的分解過程。研究發(fā)現(xiàn),ATGL在甘油三酯分解代謝的基礎(chǔ)脂解以及腎上腺素等刺激后引起的脂解過程中可能都發(fā)揮著重要的作用,ATGL是脂解過程中的重要的限速酶。ATGL基因敲除后,小鼠出現(xiàn)多器官中甘油三酯堆積、以致嚴(yán)重影響了其心臟功能、引起小鼠早期死亡；在人體,ATGL基因突變后也可以引起器官中中性脂肪的堆積。亞臨床甲狀腺功能減退癥(subclinical hypothyroidism, SCH),即我們簡稱的亞甲減,是指血液中促甲狀腺激素(TSH)的水平高于正常、而游離甲狀腺素即游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素(FT4)水平在正常參考值范圍內(nèi),它可能是甲狀腺功能減退的早期階段。臨床資料顯示：亞臨床甲狀腺功能減退與高脂血癥、肥胖等相關(guān),TSH與體重正相關(guān),這說明TSH可能參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的脂肪代謝。TSH是體內(nèi)調(diào)控甲狀腺功能的重要的蛋白分子,它由腺垂體分泌,在體內(nèi)與促甲狀腺激素受體(TSHR)結(jié)合后發(fā)揮其生理作用。近年來的研究證明,TSHR也在脂肪細(xì)胞上表達(dá)、具有一定的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能：TSH可以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向成熟的脂肪細(xì)胞分化,另有研究稱TSH也可以促進(jìn)甘油三酯分解,但目前,TSH對脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯分解代謝過程中的限速酶之一的ATGL的表達(dá)有無影響尚未見報道,在本實(shí)驗(yàn)中,我們試圖從體內(nèi)、體外水平觀察TSH能否影響ATGL的表達(dá)及其可能的分子機(jī)制。目的：1.脂肪細(xì)胞已經(jīng)被證明可以表達(dá)功能性TSHR,本課題擬觀察Tshr-/-小鼠附睪脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá)；另外在體外實(shí)驗(yàn)中用TSH處理誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞,觀察TSH對ATGL表達(dá)的影響,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)來探討TSH在脂解過程中可能發(fā)揮的作用,揭示亞臨床甲減致肥胖的可能分子機(jī)制。2、利用cAMP激動劑forskolin和PKA抑制劑H89及TSH分別處理誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞,觀察細(xì)胞中ATGL的表達(dá),以此來觀察cAMP/PKA通路是否參與了TSH對ATGL的作用、揭示其可能的作用機(jī)制。研究方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)：按照培養(yǎng)方案將3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞通過誘導(dǎo)分化、培養(yǎng)成為成熟的脂肪細(xì)胞,在將細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化的過程中,分別觀察不同天數(shù)時細(xì)胞中ATGL的表達(dá)。并用0.1 u M、1 u M、2 μ M的bTSH分別處理分化成熟的脂肪細(xì)胞24小時及48小時,然后觀察細(xì)胞中ATGL表達(dá)的變化。2、動物模型：Tshr-/-小鼠及Tshr+/+/小鼠飼養(yǎng)于屏障(SPF)環(huán)境中,按照白天與夜晚各12小時予以晝夜循環(huán),飼料和水自由攝入。4-6周斷乳后對雄性小鼠進(jìn)行基因型鑒定,按照基因型鑒定結(jié)果將同窩雄性小鼠分為三組：Tshr+/+、Tshr+/-和Tshr-/-, Tshr-/-組小鼠予以外源性補(bǔ)充T4；Tshr-/-小鼠和Tshr+/+小鼠用于實(shí)驗(yàn)。3、利用油紅0染色觀察脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的情況。4、采用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中ATGL基因mRNA的表達(dá)。5、采用Western Blotting方法檢測細(xì)胞中ATGL蛋白的表達(dá)。6、采用免疫熒光方法觀察ATGL在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)和分布。7、采用免疫組化方法觀察ATGL在脂肪組織細(xì)胞中的表達(dá)及分布。8、采用SAS系統(tǒng)和SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計量資料采用x±s做描述,多組均數(shù)比較采用方差分析,方差不齊的采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。結(jié)果：1小鼠Tshr基因敲除后附睪周圍脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL的表達(dá)明顯增加我們應(yīng)用免疫組化技術(shù),觀察了Tshr-/-小鼠和Tshr+/+小鼠附睪周圍脂肪組織石蠟切片中脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL的分布和表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示：在小鼠附睪周圍脂肪組織石蠟切片中,脂肪細(xì)胞中的脂滴呈空泡狀,細(xì)胞核被脂滴擠到一邊,緊貼細(xì)胞膜,ATGL呈棕黃色,分布于細(xì)胞質(zhì)中,亦被脂滴擠到一邊、緊貼細(xì)胞膜；與Tshr+/+小鼠相比,Tshr-/-小鼠脂肪組織石蠟切片中,脂肪細(xì)胞中ATGL表達(dá)增多。同時,我們用Western blotting方法和RT-PCR方法分貝檢測了附睪脂肪組織中ATGL蛋白的表達(dá)和mRNA的表達(dá)。與Tshr+/+小鼠相比,Tsh-/-小鼠附睪脂肪細(xì)胞中ATGL的蛋白表達(dá)及RNA表達(dá)都明顯增加,這些都提示TSH可能抑制脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá)。2.TSH抑制成熟3T3-L1細(xì)胞中ATGL的表達(dá)2.1在3T3-L1細(xì)胞被誘導(dǎo)分化的過程中,細(xì)胞中的ATGL的蛋白表達(dá)逐漸增加。在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中,ATGL的蛋白表達(dá)量很少,隨著誘導(dǎo)分化過程中天數(shù)的增加,細(xì)胞中ATGL的蛋白量逐漸增加,至D16天,80%--90%的前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞,ATGL的蛋白表達(dá)量最高。2.2 TSH抑制成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá)我們分別用0.1 μM、1 μ M、2μ M bTSH處理成熟脂肪細(xì)胞24小時和48小時,發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比,bTSH刺激后成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL表達(dá)明顯減少：處理24小時后,0.1 μM、1 μM與2 μMbTSH處理組與對照組相比,細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白含量分別減少了31.1%(p0.01)、57.3%(p0.01)和58.1%(p0.01)；處理48小時后,0.1μ M、1μ M與2μ MbTSH處理組與對照組相比,細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白含量分別減少了45.1%(p0.01)、60.5%(p0.01)和77.1%(p0.01),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。bTSH對ATGL的這種抑制作用呈明顯的劑量依賴性,尤其在細(xì)胞被bTSH處理48小時后,不同劑量組間的差異顯著(皆p0.01)。但bTSH對ATGL的抑制作用在0.1μM和1 μM時并沒有表現(xiàn)出顯著的時間依賴性：0.1μM bTSH分別處理細(xì)胞24小時和48小時后,細(xì)胞內(nèi)的ATGL的蛋白表達(dá)均減少,但兩組ATGL減少的量之間的差異并不顯著；同樣,應(yīng)用1 μMbTSH分別處理細(xì)胞24小時和48小時后,兩組細(xì)胞內(nèi)的ATGL的蛋白表達(dá)均減少,但兩組ATGL減少的量之間的差異也并不顯著。但是應(yīng)用2μM bTSH分別處理細(xì)胞48小時后,細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白表達(dá)的減少較處理24小時后ATGL表達(dá)的減少更顯著(p0.01)。用2 μMbTSH處理成熟脂肪細(xì)胞48小時后,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)觀察細(xì)胞中ATGL的mRNA含量變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中ATGL的mRNA的含量較空白對照組減少約70%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。以上結(jié)果顯示,bTSH可以抑制成熟脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá),這種作用呈劑量依賴性。3 TSH通過激活cAMP/PKA途徑抑制ATGL的表達(dá)3.1 cAMP激動劑forskolin可以抑制成熟3T3-L1細(xì)胞中ATGL的表達(dá)3T3-L1細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后,分別用濃度為2.5uM和5uM的forskolin處理細(xì)胞24小時后,應(yīng)用Western blotting方法檢測細(xì)胞中ATGL的蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),和對照組相比,2.5uM處理組細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白含量減少了47%(p0.01),5uM處理組細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白含量減少了52%(p0.01)。3.2 PKA抑制劑H89對于成熟3T3-L1細(xì)胞中ATGL的表達(dá)無明顯影響將3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后,分別用濃度為5uM和10uM的H89處理細(xì)胞24小時后,應(yīng)用Western blotting方法檢測細(xì)胞中ATGL的蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),和對照組相比,兩個處理組細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白的含量幾乎無變化(p0.05)。3.3 TSH通過激活cAMP/PKA途徑抑制成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL的表達(dá)將3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。先用10uM的H89預(yù)處理細(xì)胞1小時,然后加入2uM的bTSH;其它幾皿的細(xì)胞,則分別單獨(dú)加入2uM的bTSH、5uM的forskolin和10uM的H89,另外一皿細(xì)胞則作為空白對照組。細(xì)胞被處理24小時后,應(yīng)用Western blotting方法和免疫熒光方法檢測細(xì)胞中ATGL的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示：與對照組相比,bTSH處理細(xì)胞組及forskolin處理細(xì)胞組細(xì)胞內(nèi)ATGL的表達(dá)均明顯受到抑制(p0.01,p0.01)；H89處理細(xì)胞組,脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL的蛋白含量無明顯變化；同樣,用H89預(yù)處理后再用bTSH處理的細(xì)胞組,細(xì)胞內(nèi)ATGL的蛋白含量較對照組也沒有明顯變化。免疫熒光結(jié)果與Western blotting結(jié)果一致,免疫熒光結(jié)果顯示：ATGL表現(xiàn)為紅色熒光,位于成熟脂肪細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi),與對照組相比,bTSH及forskolin處理組細(xì)胞內(nèi)ATGL的熒光亮度明顯減弱,H89處理組ATGL的熒光亮度較對照組相比無明顯變化,同樣,用H89預(yù)處理后再用bTSH處理的細(xì)胞組,細(xì)胞內(nèi)ATGL的熒光亮度較對照組也沒有顯著變化。綜合上述結(jié)果說明,forskolin可以增加細(xì)胞內(nèi)cAMP含量、激活PKA,從而可以抑制ATGL的表達(dá)；而當(dāng)先利用H89將PKA的活性抑制后,再用TSH處理細(xì)胞,TSH與TSHR結(jié)合后無法活化PKA,從而無法發(fā)揮TSH對ATGL的抑制作用。結(jié)論：1、TSH對脂肪細(xì)胞中甘油三酯的分解代謝具有調(diào)節(jié)作用。2、TSH可以抑制小鼠成熟脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá)。3、TSH通過激活cAMP/PKA通路來發(fā)揮抑制ATGL表達(dá)的作用。意義：亞臨床甲減的患病人數(shù)逐漸增加,它與許多疾病相關(guān),但對其的診斷和治療都缺乏有力的證據(jù)；本研究豐富了TSH的甲狀腺外作用的內(nèi)容,指出了其在甘油三酯代謝中發(fā)揮的部分作用,為臨床工作提供了新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R589.2

【引證文獻(xiàn)】

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1 秦燕;飼料中添加二氫吡啶和注射三碘甲腺原氨酸（T3）對尼羅羅非魚機(jī)體脂肪沉積及相關(guān)脂解基因表達(dá)的影響[D];華東師范大學(xué);2017年

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本文編號：2468324