【摘要】：研究背景隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)和人民生活水平提高,交通意外傷及建筑工人意外導(dǎo)致的骨折發(fā)病率逐年遞增,各種類型的骨折其治療方式不盡相同,但最終治療的目的為恢復(fù)骨折斷端的連續(xù)性和骨的穩(wěn)定性。影響骨折愈合的因素很多,例如特殊部位的骨折或嚴(yán)重的開放性骨折,通常會(huì)伴隨骨折斷端血管及神經(jīng)的副損傷,在骨折修復(fù)過(guò)程中,骨折斷端周圍的缺血、缺氧和周圍組織的炎癥反應(yīng),均會(huì)影響骨折愈合的時(shí)間和程度,臨床也經(jīng)常出現(xiàn)骨折斷端周圍環(huán)境缺氧和炎癥反應(yīng)而未及時(shí)處理導(dǎo)致骨折愈合不良,延遲愈合或者是骨折不愈合,不但會(huì)給患者帶來(lái)不必要的痛苦,也會(huì)給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此,研究骨折不愈合的因素,如何人為地從外界通過(guò)藥物或手術(shù)干擾促進(jìn)骨折愈合成為臨床急需解決的問(wèn)題。通常狀態(tài)下,骨折斷端周圍血管的損傷或者是新生骨痂周圍血管再生被抑制,均會(huì)導(dǎo)致斷端缺血缺氧,從而抑制骨折愈合；而在缺氧環(huán)境下骨折斷端周圍釋放的缺氧誘導(dǎo)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等可以促進(jìn)骨折愈合。有研究通過(guò)骨折固定術(shù)后周圍組織注射血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來(lái)提高骨折愈合的比率,但由于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴,或者還需要其他療法的參與,因此難以在臨床中實(shí)施。另外有研究發(fā)現(xiàn),嚴(yán)重創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致局部或全身的炎癥反應(yīng)。而在創(chuàng)傷愈合與骨折愈合過(guò)程中各種免疫細(xì)胞激活,細(xì)胞因子被釋放,激活的細(xì)胞和釋放的因子均參與到骨折愈合的各個(gè)階段,在骨折愈合的早期,免疫細(xì)胞就已經(jīng)開始滲入到骨折斷端血腫內(nèi)。在骨折早期,缺氧就可以導(dǎo)致白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)上調(diào),從而調(diào)節(jié)骨折斷端周圍的微環(huán)境。但是對(duì)于骨折愈合過(guò)程中的炎癥反應(yīng)機(jī)制目前尚不清楚。研究表明,在全身敗血癥動(dòng)物模型中,高遷移組蛋白B1 (high mobility group box-1 protein, HMGB1)是最早被確認(rèn)的缺氧類因子。至今學(xué)術(shù)界認(rèn)為,高遷移率族蛋白B1是多種損傷模型例如肺損傷、肝臟局部缺血再灌注、失血性休克等關(guān)鍵的炎癥因子,高遷移率族蛋白B1與Toll樣受體(toll-like family of receptors, TLRs)結(jié)合啟動(dòng)損傷最初的炎癥反應(yīng),然而對(duì)于高遷移率族蛋白B1在骨折愈合中對(duì)于炎癥反應(yīng)的應(yīng)答作用機(jī)制尚不清楚。另外骨形態(tài)發(fā)生蛋白尤其是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和骨鈣蛋白可以在一定程度上緩解低氧對(duì)于骨間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)骨折的影響,但是長(zhǎng)期的缺氧將會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞和骨間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡甚至壞死。此外許多研究表明,N-甲基吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)是在醫(yī)療器械上使用的安全的具有生物活性藥物,尤其是近年來(lái)有報(bào)道,在體內(nèi),N-甲基吡咯烷酮對(duì)于兔顱骨損傷具有一定的促進(jìn)骨化和修復(fù)的作用,因此N-甲基吡咯烷酮可能對(duì)骨質(zhì)疏松、骨折愈合或者其他骨量丟失的疾病具有一定的療效。也有研究表明,N-甲基吡咯烷酮具有一定的抗炎作用,其能與脂多糖結(jié)合抑制炎癥過(guò)程。N-甲基吡咯烷酮能夠抑制炎癥中脂多糖導(dǎo)致的TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS和COX-2等炎癥因子的生成,其主要是通過(guò)降低NF-κ B信號(hào)途徑發(fā)揮抑制炎癥因子生成的作用。因此本文分別通過(guò)兩個(gè)方面研究缺氧狀態(tài)下可能影響骨折愈合的信號(hào)通路,首先我們通過(guò)在缺氧狀態(tài)下骨折斷端血腫細(xì)胞中和巨噬細(xì)胞檢測(cè)高遷移率族蛋白B1水平,并研究高遷移率族蛋白B1在常氧和缺氧環(huán)境中如何激發(fā)Toll樣受體的信號(hào)過(guò)程促進(jìn)成骨細(xì)胞中的增殖規(guī)律。同時(shí)我們對(duì)在常氧和缺氧環(huán)境下檢測(cè)了成骨細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinsaes. ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化,并將xx-特異性的siRNA轉(zhuǎn)染到缺氧環(huán)境中的成骨細(xì)胞,并用高遷移率族蛋白B1干擾,檢測(cè)了細(xì)胞增殖特性和ERK/JNK的磷酸化。研究的第一部分主要探討低氧下,通過(guò)TLR-4信號(hào)通路高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)影響ERK/JNK磷酸化和成骨細(xì)胞分化增殖的機(jī)制。第二部分我們要研究N-甲基吡咯烷酮在低氧環(huán)境下對(duì)成骨細(xì)胞凋亡和分化的作用,并且從分子水平分析N-甲基吡咯烷酮對(duì)成骨細(xì)胞作用的相關(guān)機(jī)制,本文的成果可能解釋N-甲基吡咯烷酮可能促進(jìn)低氧環(huán)境中成骨細(xì)胞增殖分化修復(fù)骨折的能力,也為探索骨折不愈合的機(jī)制,研制治療骨不連的藥物提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。研究目的1、探討低氧下,通過(guò)TLR-4信號(hào)通路高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)影響ERK/JNK磷酸化和成骨細(xì)胞分化增殖的機(jī)制,為臨床骨不連的治療提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論。2、探討低氧下,通過(guò)NF-κB信號(hào)通路N-甲基吡咯烷酮(NMP)影響成骨細(xì)胞分化的機(jī)制,為N-甲基吡咯烷酮的臨床應(yīng)用提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。研究方法第一部分：1.樣本的制備及分組選自2014年3月至2015年3月來(lái)自于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科31例股骨干骨折病例,在手術(shù)前經(jīng)患者簽署知情同意書,經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)倫理審核后,在手術(shù)中獲取骨折周圍血腫樣本和新鮮血液樣本。在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937細(xì)胞,并在培養(yǎng)中加入10%或2%的小牛血清,50μg/ml的青霉素和50μg/ml的鏈霉素,先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心分離按照1-2×105活細(xì)胞/mL再懸浮,每三到四天更換新的培養(yǎng)液(依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的密度)。在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)MG-63細(xì)胞,并在培養(yǎng)中加入10%的小牛血清,50μg/ml的青霉素和50μg/ml的鏈霉素,將兩類細(xì)胞在5%CO2,在37℃的環(huán)境下放置于細(xì)胞培養(yǎng)皿上。低氧環(huán)境造模方法,將細(xì)胞在5%CO2和氮?dú)饧?%的氧氣混合氣體中培養(yǎng)。在高遷移率族蛋白B1檢測(cè)試驗(yàn)中,將組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937細(xì)胞放置于常氧和低氧環(huán)境中培養(yǎng)8,12和24小時(shí),然后將懸浮組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937細(xì)胞收集,并進(jìn)行高遷移率族蛋白B1的檢測(cè)。在RPMI-1640 (2% FBS)上培養(yǎng)85-95%細(xì)胞融合度的MG-63細(xì)胞,在常氧和低氧環(huán)境下混合0,0.2或者1μg/mL高遷移率族蛋白B1培養(yǎng)24,48和72小時(shí)；將siRNA-TLR-4和control siRNA混有30和60 nM脂質(zhì)體2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞造模敲除MG-63細(xì)胞的TLR-4。2.高遷移率族蛋白B1的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為了檢測(cè)骨折斷端血腫樣本和新鮮血液樣本中以及巨噬細(xì)胞U937的高遷移率族蛋白B1的水平,按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作檢測(cè),實(shí)驗(yàn)板孔中連續(xù)滴加100μL標(biāo)準(zhǔn)液和樣本,并在37℃環(huán)境下孵育2小時(shí),然后吹吸樣本,然后用100μ混有PBST的磷酸鹽溶液沖洗四次,然后將100μL高遷移率族蛋白B1抗體加入孔中,37攝氏度下孵育一小時(shí),沖洗四次,每孔再加入100μL螯合有辣根過(guò)氧化物酶的二抗37攝氏度下孵育30分鐘,在黑暗環(huán)境下每孔加入100μL的終止液并放置15分鐘,封板后在450nm酶標(biāo)儀中測(cè)量數(shù)據(jù)。3.mRNA的提取和定量分析MG-63的nRNA用TRizol reagent試劑盒進(jìn)行提取,mRNA的含量用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行測(cè)量,MG-63細(xì)胞中的ERK,JNK, TLR-Tubulin的mRNA含量用SYBR Green PCR Kits試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè),定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitativepolymerase chain reaction, qPCR)過(guò)程在ABI PRISM 7300檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行,引物鏈?zhǔn)怯缮虾Ｉす竞铣?所有的檢測(cè)都是利用AACt方法,檢測(cè)結(jié)果都是待檢物和內(nèi)參比較的倍數(shù)。4.免疫印跡實(shí)驗(yàn)利用NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抽提檢測(cè)試劑盒抽提細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞核蛋白,利用蛋白酶抑制劑雞尾酒試劑盒進(jìn)行蛋白增補(bǔ),10%或12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本,再將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜,然后將膜用2%BSA封閉,4攝氏度下過(guò)夜,然后轉(zhuǎn)移到非特異性結(jié)合膜,用兔多克隆IgG結(jié)合高遷移率族蛋白B1、ERK磷酸化或非磷酸化Thr202/Thr204, JNK磷酸化或非磷酸化Thr183,TLR-4和微管蛋白,用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)特異性結(jié)合,高遷移率族蛋白B1或TLR-4的含量水平用相對(duì)于微管蛋白的灰度值表示,p-ERK或p-JNK的結(jié)果用相對(duì)于ERK、JNK的灰度值表示。5.CCK-8的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MG-63在常氧和缺氧環(huán)境下的增殖測(cè)量,以及MG-63細(xì)胞在高遷移率族蛋白B1處理或未處理,或者M(jìn)G-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-TLR-4和siRNA-Con的增殖測(cè)量都用CCK-8實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)量。其測(cè)量方法簡(jiǎn)言之,就是每組MG-63細(xì)胞與CCK-8共培養(yǎng),在490nm,檢測(cè)各類樣本的吸光度。第二部分：1.細(xì)胞培養(yǎng)人類成骨細(xì)胞hFOB 1.19在1：1混合Ham's F12的基質(zhì)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)培養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)液中添加2.5 mM左旋谷酰胺和0.3mg/ml G418 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA),并且添加10%小牛血清hFOB 1.19細(xì)胞在5% CO2,37℃環(huán)境下溫箱中培養(yǎng)。低氧環(huán)境造模方法,將細(xì)胞在5% CO2和氮?dú)?%的氧氣混合氣體中培養(yǎng)。持續(xù)監(jiān)測(cè)氧的濃度,N-甲基吡咯烷酮分別配成0,3,10和30 mM濃度的溶液與成骨細(xì)胞混合。2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)BMP-2, PINP, ALP和RUNX-2檢測(cè)人類成骨細(xì)胞hFOB 1.19 cells中細(xì)胞內(nèi)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,骨膠原前肽I(propeptide of type I procollagen I, PINP)、堿性磷酸酶和成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-2(Runt-related transcription factor-2, RUNX-2)表達(dá)水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè),全部檢測(cè)步驟參照相應(yīng)的試劑說(shuō)明書。培養(yǎng)板上對(duì)照孔連續(xù)滴加100μL標(biāo)準(zhǔn)液和hFOB 1.19細(xì)胞,4℃下過(guò)夜培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)盤中滴加100μL抗體溶液(抗BMP2, PINP, ALP和RUNX2),37℃下培養(yǎng)1小時(shí),然后加入100μL辣根過(guò)氧化物酶二抗37℃下培養(yǎng)半小時(shí),在每次孵育前,用添加PBST的磷酸鹽緩沖劑清洗培養(yǎng)板四次,最后在培養(yǎng)板上滴加100 μL終止液,暗室中放置15分,在450 nm下用分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。3.利用RT-qPCR法檢測(cè)p65 mRNA,用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書,用Total Nucleic Acid Isolation Kit試劑盒提取hFOB 1.19的mRNA,最后添加1μl RNasin(?) Plus RNase的終止液,用Takara One Step RT-PCT kit檢測(cè)p65 mRNA的含量,通過(guò)p65-特異性引物(正：5'-tgatcactaagcaggaagatgtg-3',反：5'-gaaggctcaggtcggccccag-31).利用AACt法定量測(cè)量p65比β-actin的相對(duì)量ohFOB 1.19細(xì)胞移植到96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)至85%細(xì)胞融合度,hFOB 1.19細(xì)胞用NF-κB熒光素酶轉(zhuǎn)染,依據(jù)Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)檢測(cè)系統(tǒng)的說(shuō)明書檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的NF-κB的濃度。4.蛋白分離和免疫印跡實(shí)驗(yàn)利用Nuclear/Cytosol Fractionation Kit試劑盒,參照其說(shuō)明書對(duì)5×105 hFOB1.19細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取,分別對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的溶解物進(jìn)行提取,并加入蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),用 BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA)試劑盒定量檢測(cè)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中溶解物。利用12% SDS-PAGE梯度凝膠分離待檢蛋白p65和IκB,然后轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維膜上,為了阻斷特異性結(jié)合部位,用兔多克隆抗體與p65, IκB和內(nèi)參β-actin結(jié)合,2%BSA孵育硝酸纖維素膜(4℃過(guò)夜),然后辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗羊抗兔抗體室溫下進(jìn)行孵育1小時(shí),每次孵育前都要用l×磷酸Phosphate Buffered Saline Tween-20 (PBST)沖洗三次,p65, IκB和β-actin蛋白含量用增強(qiáng)化學(xué)免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)。5.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力用MTT法檢測(cè)hFOB 1.19細(xì)胞活力,以下簡(jiǎn)單描述MTT法,hFOB 1.19細(xì)胞在常氧,低氧及合并N-甲基吡咯烷酮的作用下與MTT試劑37℃下孵育3小時(shí),在450 nm下用分光光度計(jì)測(cè)量其濃度,結(jié)果用OD450值表示。統(tǒng)計(jì)分析全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)置為0.05,當(dāng)P0.05時(shí)兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一部分：1.在低氧環(huán)境中骨折斷端血腫標(biāo)本、巨噬細(xì)胞U937中高遷移率族蛋白B1含量上調(diào)。為了研究在骨折過(guò)程中高遷移率族蛋白B1的作用,我們首先在骨折斷端血腫中檢測(cè)了高遷移率族蛋白B1的含量,其中骨折斷端血腫標(biāo)本來(lái)源于臨床股骨干骨折的手術(shù)治療患者,另外我們選取了相同病患的新鮮血液標(biāo)本作為對(duì)照組,結(jié)果骨折斷端血腫標(biāo)本中高遷移率族蛋白B1的含量為(31.730±3.197)ng/mL,遠(yuǎn)高于新鮮血液標(biāo)本中高遷移率族蛋白B1的含量(9.845±0.967 ng/mL),經(jīng)檢驗(yàn)P0.0001,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接著我們研究了缺氧下人類巨噬細(xì)胞中高遷移率族蛋白B1的含量,其中巨噬細(xì)胞是高遷移率族蛋白B1的主要來(lái)源細(xì)胞。缺氧處理12小時(shí)到48小時(shí),與相同時(shí)間常氧狀態(tài)下比較,U937巨噬細(xì)胞高遷移率族蛋白B1的水平上調(diào)。同時(shí)我們也測(cè)量了U937細(xì)胞在常氧和缺氧環(huán)境下細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中高遷移率族蛋白B1的分布,細(xì)胞核中的高遷移率族蛋白B1在常氧和缺氧環(huán)境中無(wú)差異,然而,在細(xì)胞質(zhì)中,缺氧環(huán)境下,高遷移率族蛋白B1的含量上調(diào)。在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)24和48小時(shí),細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核中的高遷移率族蛋白B1的比值上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.高遷移率族蛋白B1促進(jìn)成骨細(xì)胞MG-63增殖并且上調(diào)TLR-4。將0、0.2和1μg/mL三種濃度的高遷移率族蛋白B1加入MG-63的培養(yǎng)皿,檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線。我們發(fā)現(xiàn),在常氧環(huán)境下,0.2μg/mL的高遷移率族蛋白B1可以使MG-63細(xì)胞增殖水平增高,而1μg/mL高遷移率族蛋白B1促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖水平最高,以上研究均說(shuō)明,在常氧環(huán)境下高遷移率族蛋白B1對(duì)于MG-63具有促進(jìn)其增殖的作用,同樣在缺氧環(huán)境中高遷移率族蛋白B1對(duì)于MG-63也具有促進(jìn)其增殖的作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1-5,表1-3)。0.2μg/mL高遷移率族蛋白B1處理MG-63細(xì)胞24,48,72小時(shí)后,可以顯著性的抑制該細(xì)胞的活性下降。同時(shí)我們檢測(cè)了在常氧和缺氧狀態(tài)下高遷移率族蛋白B1干擾MG-63細(xì)胞中TLR-4的水平。免疫印跡反應(yīng)結(jié)果顯示,特別是在對(duì)MG-63細(xì)胞施以0.2μg/mL高遷移率族蛋白B1干擾后,在缺氧狀態(tài)下MG-63細(xì)胞中TLR-4水平顯著性提高。因此在缺氧狀態(tài)下,高遷移率族蛋白B1可以促進(jìn)MG-63細(xì)胞的增殖,并且使TLR-4水平上調(diào)。3.高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞中ERK和JNK的磷酸化。在常氧和缺氧狀態(tài)下利用高遷移率族蛋白B1干擾MG-63細(xì)胞后測(cè)量ERK和JNK的磷酸化和表達(dá)水平。在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)MG-63細(xì)胞12小時(shí)后,ERK的mRNA水平顯著性增高,高遷移率族蛋白B1(0.2μg/mL)干擾還會(huì)促使ERK的mRNA水平進(jìn)一步增高,且增高水平持續(xù)到干擾后24小時(shí)。在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)MG-63細(xì)胞12小時(shí)后,JNK的mRNA水平顯著性增高。缺氧處理MG-63后ERK和JNK的磷酸化水平顯著性升高,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05或p0.01)。且缺氧處理MG-63并用高遷移率族蛋白B1干擾后,ERK和JNK的磷酸化水平還會(huì)繼續(xù)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(p0.01)。以上研究結(jié)果說(shuō)明高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞中ERK和JNK表達(dá)水平增加和磷酸化。4.MG-63細(xì)胞TLR-4低表達(dá)后可以抑制高遷移率族蛋白B1促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖的作用。利用TLR-4-特意的siRNA在常氧環(huán)境下使MG-63細(xì)胞的TLR-4的表達(dá)沉默,用30或60 nM siRNA-TLR-4對(duì)MG-63細(xì)胞進(jìn)行敲除,兩組的TLR-4 mRNA水平從分別從(1.00±0.12)和(1.00±0.13)降到(0.53±0.058)和(0.32±0.037),均為p0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1-13)。另外與對(duì)照組siRNA-Con相比較,siRNA-TLR-4轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后置于缺氧環(huán)境中24、48小時(shí)會(huì)明顯抑制MG-63中TLR-4的表達(dá)生成(p0.05或p0.01)。然后用60 nM siRNA-TLR-4和siRNA-Con轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后置于缺氧和常氧環(huán)境下,我們繪制MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示與對(duì)照組siRNA-Con相比較, siRNA-TLR-4轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后在常氧環(huán)境中24、48、72小時(shí)會(huì)明顯抑制MG-63細(xì)胞的增殖水平(p0.05或p0.01,見(jiàn)圖1-15)。另外與對(duì)照組siRNA-Con相比較,siRNA-TLR-4轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后會(huì)明顯降低MG-63細(xì)胞的活性(p0.05或p0.01,見(jiàn)圖1-16)。綜上所述,高遷移率族蛋白B1在常氧環(huán)境下促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖的作用依賴TLR-4,或者說(shuō)高遷移率族蛋白B1可以介導(dǎo)提高在低氧環(huán)境下MG-63的細(xì)胞活力。5.TLR-4低表達(dá)后降低了MG-63細(xì)胞中,高遷移率族蛋白B1-誘導(dǎo)的ERK和JNK磷酸化。通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)通過(guò)60 nM siRNA-TLR-4和對(duì)照組siRNA-Con轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞中ERK和JNK磷酸化水平。與對(duì)照組siRNA-Con相比,轉(zhuǎn)染siRNA-TLR-4后24或48小時(shí),可以顯著地抑制低氧誘導(dǎo)的ERK磷酸化(p0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣轉(zhuǎn)染60 nM siRNA-TLR-4后,可以顯著地抑制低氧誘導(dǎo)的JNK磷酸化(p0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們認(rèn)為,低氧環(huán)境下,TLR-4的低表達(dá)降低了MG-63細(xì)胞中高遷移率族蛋白B1-誘導(dǎo)的ERK和JNK磷酸化水平。第二部分：1.低氧誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白下調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨膠原前肽Ⅰ,堿性磷酸酶和RUNX2蛋白的高表達(dá)是成骨細(xì)胞分化增殖的特征性標(biāo)志。為了驗(yàn)證以上結(jié)果,我們首先利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)量在常氧和低氧狀態(tài)下hFOB 1.19細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨膠原前肽Ⅰ、堿性磷酸酶和RUNX2蛋白的表達(dá)情況。在hFOB 1.19細(xì)胞中,在各個(gè)時(shí)間段,缺氧環(huán)境中BMP-2的表達(dá)量顯著性低于常氧狀態(tài)(p0.05或p0.01處理后6,12或24小時(shí))。缺氧環(huán)境中PINP、ALP、RUNX2的表達(dá)量顯著地低于常氧狀態(tài)(p0.05或p0.01處理后6、12或24小時(shí))。2.低氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞去分化激活NF-κB信號(hào)低氧能夠在神經(jīng)元、T淋巴細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和各類的腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)NF-κB通路。我們?cè)诔Ｑ鹾偷脱鯛顟B(tài)下培養(yǎng)hFOB 1.19細(xì)胞0、 6、12或24小時(shí),通過(guò)在hFOB 1.19細(xì)胞內(nèi)激活NF-κB通路,低氧環(huán)境中的hFOB 1.19細(xì)朐p65 mRNA表達(dá)水平增高(p0.01或p0.001)。免疫印跡技術(shù)定性分析實(shí)驗(yàn)也證明,低氧環(huán)境中處理hFOB 1.19細(xì)胞12或24小時(shí)后,hFOB 1.19細(xì)胞p65蛋白表達(dá)水平增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05或p0.01)。而NF-κB的阻滯劑IκB,在hFOB 1.19細(xì)胞中下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05或p0.01)。為了進(jìn)一步證實(shí)低氧可以激活NF-κB通路,我們利用NF-κB熒光素酶檢測(cè)NF-κB的活性狀態(tài),其中NF-κB熒光素酶含有四個(gè)NF-kB結(jié)合位(圖2-9)。與常氧下hFOB 1.19細(xì)胞相比,低氧可以激活兩倍量NF-kB熒光素酶(p0.01或p0.001),以上結(jié)果表明,低氧可以誘導(dǎo)p65的表達(dá)和激活。3.N-甲基吡咯烷酮影響低氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化為研究N-甲基吡咯烷酮影響低氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化的可能機(jī)制,我們同時(shí)檢測(cè)了低氧環(huán)境中N-甲基吡咯烷酮處理過(guò)的hFOB 1.19細(xì)胞中BMP-2, PINP,ALP和RUNX2的含量。我們首先研究了在低氧和常氧環(huán)境下N-甲基吡咯烷酮對(duì)hFOB 1.19細(xì)胞活力的影響,在常氧環(huán)境下N-甲基吡咯烷酮對(duì)hFOB 1.19細(xì)胞活力無(wú)任何影響,而在低氧環(huán)境下N-甲基吡咯烷酮干擾hFOB 1.19細(xì)胞12、24小時(shí)后,可以減輕低氧對(duì)hFOB 1.19細(xì)胞活力的影響(p0.05或p0.01),組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。N-甲基吡咯烷酮減輕低氧對(duì)hFOB 1.19細(xì)胞活力的影響成劑量依賴性。(p0.05)接著我們用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)研究了缺氧環(huán)境中N-甲基吡咯烷酮處理的hFOB 1.19細(xì)胞中BMP-2、PINP、ALP和RUNX-2蛋白表達(dá)水平。10 mM N-甲基吡咯烷酮處理hFOB 1.19細(xì)胞12或24小時(shí)后抑制了hFOB 1.19細(xì)胞中BMP-2的含量降低。同樣10mM NMP處理hFOB 1.19細(xì)胞12或24小時(shí)后抑制了hFOB 1.19細(xì)胞中PINP的含量降低,經(jīng)比較,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。同樣N-甲基吡咯烷酮處理hFOB 1.19細(xì)胞6或24小時(shí)后也抑制了細(xì)胞中ALP和RUNX-2的含量降低(p0.05或p0.01)。綜上所述,N-甲基吡咯烷酮抑制低氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化減少和成骨細(xì)胞的活性下降。4.低氧下,N-甲基吡咯烷酮通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)hFOB 1.19細(xì)胞的分化。為了研究N-甲基吡咯烷酮對(duì)于影響低氧導(dǎo)致的成骨細(xì)胞分化降低的機(jī)制,我們重新檢測(cè)在10 mMN-甲基吡咯烷酮干擾或未加10 mMN-甲基吡咯烷酮干擾情況下,低氧誘導(dǎo)的hFOB 1.19細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路激活狀態(tài)。10 mMN-甲基吡咯烷酮干擾后,hFOB 1.19細(xì)胞中p65 mRNA的水平在低氧環(huán)境下顯著地下降,其蛋白表達(dá)也是顯著地下降,而hFOB 1.19細(xì)胞中IκB水平卻顯著地提高,(p0.01或p0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NF-κB熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí),在低氧環(huán)境下,10 Mm NMP可抑制hFOB 1.19 cells中熒光素酶的活性(p0.05或p0.01)。N-甲基吡咯烷酮抑制在hFOB 1.19細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。結(jié)論1.在低氧環(huán)境中骨折斷端血腫標(biāo)本、巨噬細(xì)胞U937中高遷移率族蛋白B1含量上調(diào)2.高遷移率族蛋白B1促進(jìn)成骨細(xì)胞MG-63增殖并且上調(diào)TLR-43.高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞中ERK和JNK的磷酸化4.MG-63細(xì)胞TLR-4低表達(dá)后可以抑制高遷移率族蛋白B1促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖的作用5.TLR-4低表達(dá)降低了MG-63細(xì)胞中高遷移率族蛋白B1-誘導(dǎo)的ERK和JNK磷酸化6.低氧誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨膠原前肽Ⅰ,堿性磷酸酶和RUNX2蛋白下調(diào)7.低氧通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞去分化激活8.N-甲基吡咯烷酮影響低氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化9.低氧下,N-甲基吡咯烷酮通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)hFOB 1.19細(xì)胞的分化
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R683

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本文編號(hào)：2353240