發(fā)布時(shí)間：2020-03-10 09:01

【摘要】：目的采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)糖蛋白E(g E)基因的胞外域,將純化后的目的蛋白免疫新西蘭家兔,制備該蛋白特異性抗血清。方法構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒g E-p ET-32a(+),測(cè)序后將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21,以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),獲得VZV g E融合蛋白。采用SDS-PAGE電泳、Western blot法鑒定其特異性,利用Ni2+-NTA柱對(duì)g E蛋白進(jìn)行純化,復(fù)性后免疫新西蘭家兔,獲得兔抗VZV g E血清;采用間接免疫熒光、Western blot法和ELISA法檢測(cè)該血清的特異性和效價(jià)。結(jié)果成功誘導(dǎo)表達(dá)出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鑒定提示其主要為包涵體表達(dá),濃度約為3.01 mg/ml。蛋白經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后,純度約為90%。Western blot法顯示,經(jīng)變性、復(fù)性后的該融合蛋白有良好的免疫反應(yīng)性。用該蛋白免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV g E血清。ELISA分析顯示,該兔抗血清的效價(jià)為1∶6 400。結(jié)論成功構(gòu)建了高效表達(dá)VZV g E蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng),獲得較高純度的g E蛋白,可以作為VZV亞單位疫苗的候選抗原,制備了特異性及效價(jià)均較高的兔抗VZV g E多克隆抗體,為VZV感染的臨床診斷及治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。
【圖文】：

量一致，表明融合蛋白主要以包涵體形式存在。見(jiàn)圖2A。圖1VZVgE基因胞外域PCＲ擴(kuò)增和gE-pET-32a(+)酶切鑒定A:VZVgE基因胞外域PCＲ擴(kuò)增圖;B:重組質(zhì)粒單、雙酶切鑒定圖;M:Marker;1:目的基因片段;2:陰性對(duì)照;3:重組質(zhì)粒;4:重組質(zhì)粒經(jīng)XholI酶切;5:重組質(zhì)粒經(jīng)HandⅢ酶切;6:重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切2．3VZVgE融合蛋白的復(fù)性、純化及鑒定取純化后的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，軟件分析顯示，其純度約為90%，見(jiàn)圖2B。Lowry法測(cè)定融合蛋白的濃度為3．01mg/ml。應(yīng)用鼠抗VZVgE單克隆抗體進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果可見(jiàn)約73ku的特異性目的條帶。見(jiàn)圖2C。圖2VZVgE融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot特異性鑒定A:融合蛋白的可溶性SDS-PAGE鑒定圖;B:純化后的融合蛋白SDS-PAGE鑒定圖;C:融合蛋白的Westernblot分析;M:Marker;1:重組菌體破碎前總蛋白;2:重組菌體破碎后上清液;3:重組菌體破碎后包涵體;4:pET-32空載體對(duì)照;5:純化前gE融合蛋白;6:純化后gE融合蛋白;7:純化前gE融合蛋白;8:純化后gE融合蛋白;9:pET-32空載體對(duì)照;10:BL21空菌對(duì)照2．4兔抗VZVgE多克隆抗體ELISA法效價(jià)檢測(cè)結(jié)果采用ELISA法檢測(cè)，結(jié)果顯示，免疫前兔陰性血清OD值為(0.253±0.037)，當(dāng)免疫后血清最大稀釋度達(dá)1∶6400時(shí)，其OD值為0.382＞s藊+3S，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，與免疫前兔陰性血清組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，即多克隆抗體效價(jià)為1∶6400。見(jiàn)圖3。2．5兔抗VZVgE多克隆抗體特異性鑒定采用間接免疫熒光法和Westernblot分析兔抗VZVgE多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，gE蛋白免疫血清僅在感染VZV的HF細(xì)胞上呈現(xiàn)典型的綠色熒光，在其他皰疹病毒感染的細(xì)胞中都不出現(xiàn)熒光。見(jiàn)圖圖3ELISA法分析兔血清中VZVgE抗體效價(jià)1:血清1∶200稀釋度;2:血清1∶400稀釋度;3:血清1∶800稀釋

白主要以包涵體形式存在。見(jiàn)圖2A。圖1VZVgE基因胞外域PCＲ擴(kuò)增和gE-pET-32a(+)酶切鑒定A:VZVgE基因胞外域PCＲ擴(kuò)增圖;B:重組質(zhì)粒單、雙酶切鑒定圖;M:Marker;1:目的基因片段;2:陰性對(duì)照;3:重組質(zhì)粒;4:重組質(zhì)粒經(jīng)XholI酶切;5:重組質(zhì)粒經(jīng)HandⅢ酶切;6:重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切2．3VZVgE融合蛋白的復(fù)性、純化及鑒定取純化后的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，軟件分析顯示，，其純度約為90%，見(jiàn)圖2B。Lowry法測(cè)定融合蛋白的濃度為3．01mg/ml。應(yīng)用鼠抗VZVgE單克隆抗體進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果可見(jiàn)約73ku的特異性目的條帶。見(jiàn)圖2C。圖2VZVgE融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot特異性鑒定A:融合蛋白的可溶性SDS-PAGE鑒定圖;B:純化后的融合蛋白SDS-PAGE鑒定圖;C:融合蛋白的Westernblot分析;M:Marker;1:重組菌體破碎前總蛋白;2:重組菌體破碎后上清液;3:重組菌體破碎后包涵體;4:pET-32空載體對(duì)照;5:純化前gE融合蛋白;6:純化后gE融合蛋白;7:純化前gE融合蛋白;8:純化后gE融合蛋白;9:pET-32空載體對(duì)照;10:BL21空菌對(duì)照2．4兔抗VZVgE多克隆抗體ELISA法效價(jià)檢測(cè)結(jié)果采用ELISA法檢測(cè)，結(jié)果顯示，免疫前兔陰性血清OD值為(0.253±0.037)，當(dāng)免疫后血清最大稀釋度達(dá)1∶6400時(shí)，其OD值為0.382＞s藊+3S，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，與免疫前兔陰性血清組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，即多克隆抗體效價(jià)為1∶6400。見(jiàn)圖3。2．5兔抗VZVgE多克隆抗體特異性鑒定采用間接免疫熒光法和Westernblot分析兔抗VZVgE多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，gE蛋白免疫血清僅在感染VZV的HF細(xì)胞上呈現(xiàn)典型的綠色熒光，在其他皰疹病毒感染的細(xì)胞中都不出現(xiàn)熒光。見(jiàn)圖圖3ELISA法分析兔血清中VZVgE抗體效價(jià)1:血清1∶200稀釋度;2:血清1∶400稀釋度;3:血清1∶800稀釋度;4:血清1∶1600稀

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