【摘要】：李斯特菌是一類(lèi)兼性厭氧、革蘭氏陽(yáng)性、呈桿狀的細(xì)菌,廣泛分布于環(huán)境、食品、人和動(dòng)物宿主體內(nèi)。迄今為止,李斯特菌屬包括15個(gè)種Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri和Listeria grayi是最常見(jiàn)的從食品、病人和環(huán)境中分離得到的六個(gè)種,被定義為常見(jiàn)李斯特菌種Listeria rocourtiae, Listeria weihenstephanensis, Listeria fleischmannii, Listeria marthii, Listeria floridensis, Listeria aquatica, Listeria cornellensis, Listeria riparia和Listeria grandensis是近年來(lái)命名的新種.常分離自然環(huán)境中,被定義為稀有李斯特菌種。李斯特菌的鑒定主要依賴(lài)傳統(tǒng)方法,包括標(biāo)本的增菌、分離培養(yǎng)以及后續(xù)的生化鑒定該方法耗、耗力、成本高：生化鑒定時(shí),反應(yīng)不穩(wěn)定,結(jié)果判牘主觀性強(qiáng),導(dǎo)致鑒結(jié)果重復(fù)性差。為J了克服傳統(tǒng)鑒定方法的不足,本研究建立了一個(gè)快速、準(zhǔn)確的多重PCR(mPCR)檢測(cè)方法。該mPCR方法包括一個(gè)屬特異性基因和五個(gè)種特異性基因,在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)鑒定李斯特菌的六個(gè)常見(jiàn)種。運(yùn)用511侏李斯特菌和15株李斯特菌(包含十五個(gè)種)進(jìn)行特異性評(píng)價(jià),所有李斯特菌株被正確分類(lèi)。該方法在實(shí)驗(yàn)室研究、臨床診斷及疫情爆發(fā)溯源調(diào)查中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在單增李斯特菌的13個(gè)血清型中,4b為優(yōu)勢(shì)致病血清型,引起人類(lèi)李斯特菌病暴發(fā)和散發(fā)。4b血清型分為四個(gè)業(yè)型(ECⅠ、ECⅡ、ECⅣ、non-EC),不同的亞型在屬主特異性、致病性及生物學(xué)特征上存在差異。本研究根據(jù)一個(gè)4b血清型特異基因利三個(gè)亞型特異基因,建立針對(duì)單增李斯特菌4b血清型四個(gè)亞型(ECI、ECII、ECIV、non-EC)的mPCR鑒定方法。建立的mPCR在一個(gè)反應(yīng)體系中能同時(shí)鑒別ECⅠ、ECⅡ、ECⅣ、non-EC,并運(yùn)用16株4b血清型單增李斯特菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證,16株4b血清型單增李斯特菌可用本方法進(jìn)行分型：其中ECI亞型11株,ECII亞型1株,ECIV亞型2株,非流行克降群(non-EC)2株。本方法能準(zhǔn)確鑒定單增李斯特菌4b血清型菌株的4個(gè)亞型,可用于食品、臨床標(biāo)本的病原學(xué)診斷和疫情暴發(fā)的溯源調(diào)查。單增李斯特菌根據(jù)分子特征和進(jìn)化分析方法,可分為四個(gè)進(jìn)化家系(Lineage Ⅰ、 Lineage Ⅱ、Lineage Ⅲ、Lineage Ⅳ)及兩個(gè)亞系(Lineage ⅢA、Lineage ⅢC)。Lineage Ⅰ可引起人類(lèi)李斯特菌病的散發(fā)和暴發(fā), Lineage Ⅱ主要分布食品和環(huán)境中,Lineage Ⅲ A、Lineage ⅢC和Lineage Ⅳ 1要來(lái)自動(dòng)物李斯特菌病病例和動(dòng)物食品。本研究以一個(gè)單增李斯特菌種特異基因和四個(gè)家系特異基因設(shè)計(jì)引物,建立針對(duì)單增李斯特菌四個(gè)進(jìn)化家系及兩個(gè)亞系的mPCR鑒定方法,運(yùn)用387株單增李斯特菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證,所有菌株均可用本方法進(jìn)行所屬家系和亞系的分型,包括Lineage Ⅰ246株、Lineage Ⅱ123株、Lineage ⅢA4株、Lineage ⅢC13株和Lineage Ⅳ 1株。本方法能準(zhǔn)確鑒定單增李斯特菌的四個(gè)進(jìn)化家系及兩個(gè)亞系的菌株,可用于食品、臨床標(biāo)本中單增李斯特菌的病原學(xué)診斷和疫情暴發(fā)時(shí)的溯源調(diào)查。相對(duì)于傳統(tǒng)的鑒定方法而言,mPCR省時(shí)、省力、檢測(cè)成本低。然而,mPCR很難對(duì)原始增菌液進(jìn)行快速檢測(cè)、依賴(lài)于熱循環(huán)設(shè)備、電泳耗時(shí)以及檢測(cè)靈敏度差。介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)作為一種新的核酸檢測(cè)手段,不依賴(lài)于設(shè)備,結(jié)果容易判讀,廣泛用于微生物領(lǐng)域的檢測(cè)LAMP技術(shù)針對(duì)靶序列的八個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)三對(duì)引物,在一小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增靶序列達(dá)109次拷貝,其特異性和敏感性都優(yōu)于Real-time PCR和PCR技術(shù)。本研究根據(jù)伊氏李斯特菌特異基因smcl設(shè)計(jì)LAMP引物,建立Listeria ivanovii-LAMP擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)條件僅需64℃水浴1小時(shí)即可,檢檢測(cè)純培養(yǎng)目的菌時(shí),檢測(cè)下限為250fg/反應(yīng)管檢測(cè)糞便模擬標(biāo)本的檢測(cè)下限為8×103CFU/g。與PCR及Real-time PCR方法相比較,LAMP方法的敏感性分別高出100和10倍L. ivanovii-LAMP引物專(zhuān)一性的擴(kuò)增伊氏李斯特菌DNA模板,非伊氏李斯特菌株不出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增為了使LAMP技術(shù)更廣泛應(yīng)用到診斷領(lǐng)域,本研究對(duì)傳統(tǒng)LAMP技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),建立多內(nèi)引物環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(MI-LAMP)與傳統(tǒng)LAMP技術(shù)相似,MI-LAMP技術(shù)反應(yīng)條件僅需恒溫水浴1小時(shí)即可,在檢測(cè)純培養(yǎng)目的菌時(shí),檢測(cè)下限為62.5fg/反應(yīng)管,且陽(yáng)性擴(kuò)增僅需15分鐘。與PCR方法相比較,MI-LAMP方法的敏感性高出400倍。此外,MI-LAMP引物專(zhuān)一性的擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的靶序列,非靶序列不出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增。LAMP作為一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),在診斷領(lǐng)域的運(yùn)用受限于單一靶標(biāo)檢測(cè),為了獲得多重LAMP檢測(cè),本研究建立了MERT-LAMP技術(shù),實(shí)現(xiàn)LAMP技術(shù)的快速,敏感及多重實(shí)時(shí)檢測(cè)。與傳統(tǒng)LAMP技術(shù)相似,MERT-LAMP技術(shù)反應(yīng)條件僅需恒溫水浴1小時(shí)即可,在檢測(cè)純培養(yǎng)目的菌時(shí),檢測(cè)下限為250fg/反應(yīng)管,且陽(yáng)性擴(kuò)增僅需12分鐘。實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)和單一目標(biāo)檢測(cè)時(shí),其敏感性不受影響。與PCR為基礎(chǔ)方法相比較,MERT-LAMP方法比普通PCR敏感100倍,比Real-time PCR方法敏感100倍。此外,MERT-LAMP引物專(zhuān)一性的擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的靶序列,非靶序列不出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增。為了豐富食源性病原體單增李斯特菌的診斷體系,CPA技術(shù)被用于檢測(cè)單增李斯特菌,建立L. monocytogenes-CPA擴(kuò)增技術(shù)。與其他恒溫技術(shù)相似,L. monocytogenes-CPA反應(yīng)條件僅需恒溫水浴1.5小時(shí)即可,然而,CPA的引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,對(duì)靶序列保守性要求較低。在檢測(cè)純培養(yǎng)單增李斯特菌時(shí),檢測(cè)下限為2.5 pg/反應(yīng)管,最快陽(yáng)性擴(kuò)增需25分鐘。與PCR為基礎(chǔ)方法相比較,L. monocytogenes-CPA方法比普通PCR敏感10倍。此外,L. monocytogenes-CPA引物專(zhuān)一性的擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的靶序列,非靶序列不出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增。在本研究論文中,建立了診斷李斯特菌的核酸檢測(cè)體系及具有應(yīng)用價(jià)值的新型恒溫檢測(cè)技術(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)李斯特菌的快速,特異,敏感及多重檢測(cè)。為食源性疾病的篩查、臨床診斷及疫情暴發(fā)溯源調(diào)查提供有價(jià)值的分子診斷技術(shù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R440
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本文編號(hào)：
2450445
