【摘要】：研究背景：近年來由于抗菌藥物廣泛使用導致耐藥致病菌迅速增加,碳青酶烯類抗生素耐藥率也在逐漸增加。碳青酶烯類抗生素耐藥的主要機制有：細菌能產β-內酰胺酶水解碳青酶烯類藥物,各種細菌胞膜對藥物的通透性降低以及細菌青霉素蛋白結合能力下降。碳青霉烯酶屬于一類能水解亞胺培南及美羅培南的β-內酰胺酶,根據其Ambler分子結構的不同分為A、B、D三類酶,而B類酶屬于金屬酶MBLs,金屬-β-內酰胺酶又稱金屬酶,能水解大部分抗生素,可被金屬螯合劑抑制抑制。新德里金屬-β-內酰胺酶-1[3](new nelhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)是碳青酶烯類酶的一種,其由基因blaNDM-1編碼,幾乎能水解所有的β-內酰胺類抗生素。全球首次于2008年報道了產NDM-1的肺炎克雷伯菌(KP05-506)和大腸埃希菌(NF-NDM-1),當時該兩株菌分別來自兩患者的尿液及糞便。隨后產NDM-1耐藥菌快速波擴散到全球各地,歐美許多國家相繼出現(xiàn)了關于NDM-1的報道。而印度因為最早出現(xiàn)產NDM-1細菌而且出現(xiàn)的病例最多,所以被認為是NDM-1發(fā)源地。主要是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌等革蘭陰性菌能產NDM-1,其他細菌如產酸克雷伯桿菌、普羅威登斯菌等也有相應報道。自上世紀90年代以來,已發(fā)現(xiàn)的有NDM-1、SIM-1、SPM-1、 GIM-1、TMB-1、DIM-1、IMP、KHM-1、SPM-1和AIM-1等金屬β-內酰胺酶,主要分布于革蘭陰性菌中,各種耐藥基因可通過質�；蛘献釉诓煌毦g水平擴散。自2010年以來我國就報道了有屎腸球菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌、臭鼻克雷伯菌等細菌能產NDM-1,而產NDM-1的陰溝腸桿菌未見報道。目前只有印度地區(qū)報道過產NDM-1陰溝腸桿菌的病例。本實驗從我院一位住院患者中分離出國內第一株產NDM-1的陰溝腸桿菌,該患者是一名67歲的女性于2012年2月13日入院,病因是連續(xù)18天咳嗽咳痰；此病人還有冠心病、Ⅱ型糖尿病等病史；入院查體：端坐呼吸,雙下肢輕度水腫,R 22次/分,雙肺呼吸音低,體溫36.2。C,氣促,P100次/分,BP 135/96mmHg。胸部CT：左肺及右肺中下葉炎癥。血常規(guī)：WBC 10.6×10~9/L, PCT 0.45 ng/ml, N 85.9%,。痰培養(yǎng)結果提示有陰溝腸桿菌生長。患者入院后,我們首先使用頭孢唑肟鈉2 g bid對其抗感染治療,但持續(xù)兩天患者并沒有獲得明顯的治療效果；血常規(guī)復查：WBC10.6×109/L,N81.9%。后更改使用莫西沙星400 mg qd加強治療。病人接受此治療八天之后病情得到明顯緩解,血常規(guī)復查結果為WBC5.52×109/L,N 67.6%,；胸部CT：肺部的炎癥減輕,其中最明顯的是左下肺。因為病人情況好轉,改用頭孢哌酮舒巴坦鈉3 g bid對其進行降階治療,病人八天之后不再有咳嗽咳痰,血常規(guī)復查：5.53×109/L,N70.7%,患者痊愈出院。此病人于2012年5月4日再次入院,病因是尿毒癥、咳嗽、咳痰,但是血常規(guī)檢查結果正常,痰液中無細菌生長；而其尿液中培養(yǎng)出大腸埃希菌,沒有發(fā)現(xiàn)攜帶NDM-1基因,對碳青霉烯類敏感,也未在患者的尿液和糞便中檢測到產NDM-1的細菌。經排查,該患者未曾到過印度或巴基斯坦等地旅游或工作。體外敏感試驗顯示：E. Cloacae 413對除外磷霉素與多粘菌素B幾乎所有抗生素耐藥。我們采用改良Hodge試驗及亞胺培南-EDTA Etest試紙條協(xié)同試驗證實分離出的陰溝腸桿菌產碳青酶烯類陽性,PCR可以從E. Cloacae413的DNA中擴增出blaNDM-1條帶,擴增產物測序確認攜帶NDN-1基因。接合實驗證實blaNDM-1可以隨著質粒在E. Cloacae 413與接合子E. coli J53 (PNDM-1)細菌間轉移,且該質粒大小約為20kb,脈沖場凝膠電泳顯示此株陰溝腸桿菌為B型,Southern blotting結果還表明blaNDM-1存在于細菌染色體的250至300KB處。我們采用PCR法及BLAST比對法發(fā)現(xiàn)E. Cloacae 413同時還攜帶blaCTX-M-14, rmtA, qnrA, qnrB, aac6'-Ib-cr五種耐藥基因,這些耐藥基因也可通過結合試驗將耐藥性傳遞給受體菌,說明這些耐藥基因可能同時位于同-質粒上。由于產NDM-1能導致細菌對幾乎所有碳青酶烯類抗生素耐藥,所以此株陰構腸桿菌的出現(xiàn)可能會導致耐藥菌蔓延,對我們控制感染性疾病造成極大的影響,所以尋找此株產NDM-1的陰溝腸桿菌的來源及傳播途徑對我們控制細菌耐藥性是很關鍵的。本文將重點探討此株產NDM-1的陰溝腸桿菌的致病性及分析其基因序列特征。目的：分析產NDM-1的陰溝腸桿菌413的體外增殖能力、致病性、生物信息學分析以及耐藥機制,從而探討其耐藥基因的可能來源及控制其可能的傳播途徑。方法：第一部分：用MTT法測定產NDM-1陰溝腸桿菌413與陰溝腸桿菌標準株4533的生長曲線并比較兩株細菌的體外增殖能力,用小鼠腹膜炎模型測定檢測產NDM-1陰溝腸桿菌413與陰溝腸桿菌標準株4533的毒力并比較兩種菌株致病能力的大小。第二部分：對陰溝腸桿菌413進行全基因組測序和序列分析,并與其他產NDM-1菌株攜帶NDM-1質粒的序列進行生物信息學比對,分析耐藥基因的可能來源及陰溝腸桿菌413遺傳特征。結果：第一部分：同一濃度的陰溝腸桿菌413及陰溝腸桿菌標準株4533兩株細菌增殖能力是不同,菌株413的增殖能力要強于標準株4533。413菌株的完全致死量和完全不致死量分別為109和104,而4533菌株的分別為1010和105；數據表明,413菌株的完全致死所需劑量明顯小于4533菌株,而且完全不致死量的結果相似,413菌株的LD5o為4.27×107,4533菌株的LD5o為1.29×108。所以413菌株的的體外繁殖能力及毒力強于標準株4533。第二部分：本實驗對E. cloacae 413細菌進行全基因組測序,明確了其基因輪廓；并構建群體系統(tǒng)發(fā)育樹,陰溝腸桿菌413含NDM-1的質粒與不動桿菌PM131含NDM-1質粒、肺炎克雷伯菌PKP_STM29含NDM-1質粒、大腸桿菌PEC STM17含NDM-1質粒、陰溝腸桿菌菌株TP15含NDM-1質粒有較高的同源性,這提示陰溝腸桿菌413含NDM-1的質粒可能是由這些細菌之間平行傳遞的。然而耐藥基因比對結果提示陰溝腸桿菌413含NDM-1的質粒所含耐藥基因在不動桿菌PM131含NDM-1質粒、肺炎克雷伯菌PKP_STM29含NDM-1質粒、大腸桿菌PEC STM17含NDM-1質粒、陰溝腸桿菌菌株TP15含NDM-1質粒里均不存在,這提示可能NDM-1是通過基因片段的插入傳遞的,也有可能其他耐藥基因在質粒傳遞過程中丟失或者藥物選擇作用出現(xiàn)了基因變異；最后解析了整個代謝通路和絕大部分基因的功能,從而發(fā)現(xiàn)產抗生素等次級代謝產物的整個調控網絡和耐藥相關基因的分布,從而為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標并從基因組角度解釋細菌耐藥性、細菌與藥物相互作用、細菌與宿主相適應性機制等提供新的思路。結論：產NDM-1陰溝腸桿菌E. cloacae 413的繁殖能力及侵襲力均強于陰溝腸桿菌標準株4533。陰溝腸桿菌413全基因測序及序列比對結果提示NDM-1的可能來源是通過基因片段的插入傳遞的,也有可能是質粒的傳遞或者藥物選擇作用出現(xiàn)了基因變異；最后解析了整個代謝通路和絕大部分基因的功能,從而發(fā)現(xiàn)產抗生素等次級代謝產物的整個調控網絡和耐藥相關基因的分布,從而為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標并從基因組角度解釋細菌耐藥性、細菌與藥物相互作用、細菌與宿主相適應性機制等提供新的思路。為我們加強耐藥菌的監(jiān)控及合理使用抗生素提供幫助。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R440

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 夏志勇,王景勝,宋麗君;從腹水中分離出1株陰溝腸桿菌[J];臨床軍醫(yī)雜志;2000年02期

2 熊武,李珍大,王衛(wèi)萍,邵海楓;從2名患者的血液及輸液殘存液中同時分離出陰溝腸桿菌[J];江西醫(yī)學檢驗;2000年03期

3 杜廷義,施莉,周兵,劉海云,曾光雄,董云華;頭孢吡肟對陰溝腸桿菌的體外抗菌活性調查[J];上海醫(yī)學檢驗雜志;2001年05期

4 任清波,辛穎;465株陰溝腸桿菌的分離及藥敏分析[J];青島醫(yī)藥衛(wèi)生;2001年02期

5 涂偉仁,張國雄,楊桂珍;腎結石患者血和尿中同時檢出陰溝腸桿菌1例[J];臨床檢驗雜志;2002年01期

6 陳如,李麗,劉守桂,張文池,熊薇,王前;臨床分離陰溝腸桿菌的耐藥性分析[J];醫(yī)學新知雜志;2003年01期

7 儲從家,孔繁林,管新龍,吳惠玲,高曉玲,羅次節(jié);62株陰溝腸桿菌的生化特性和藥敏結果[J];中國微生態(tài)學雜志;2004年05期

8 黃支密,仵蕾,糜祖煌,熊春林,鄒玉秀,秦玲,陳榆;陰溝腸桿菌β內酰胺酶基因檢測[J];東南國防醫(yī)藥;2005年05期

9 蔣曉飛,韓立中,阮斐怡,蔣筠翡,劉英,倪語星,呂元,洪秀華;紙片雙抑制劑平行抑制試驗有效分析陰溝腸桿菌產超廣譜β內酰胺酶[J];中華檢驗醫(yī)學雜志;2005年10期

10 楊�；�;陸曄玲;葉楊芹;應春妹;于嘉屏;;陰溝腸桿菌產超廣譜β內酰胺酶的研究[J];中國感染與化療雜志;2006年01期

相關會議論文 前10條

1 翁萌煒;;臨床陰溝腸桿菌感染的檢測與分析[A];2006年浙江省檢驗醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2006年

2 符生苗;李天嬌;陳淑萍;李成學;蔡俊宏;王旭明;黃濤;符惠群;;海南發(fā)現(xiàn)兩株新德里金屬β-內酰胺酶-1陽性的陰溝腸桿菌[A];2013海南省第五屆生命科學聯(lián)合學術會議論文匯編[C];2013年

3 趙樹艷;李言飛;曹建政;;陰溝腸桿菌引起醫(yī)院感染調查[A];中華醫(yī)院管理學會第十屆全國醫(yī)院感染管理學術年會論文匯編[C];2003年

4 趙德軍;曹雁;毛躍;楊圍;張碧霞;;陰溝腸桿菌院內感染的分布及藥敏分析[A];第五次全國中青年檢驗醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2006年

5 蘇維平;趙樹艷;王周波;;重癥監(jiān)護室患者陰溝腸桿菌藥敏分析[A];中華醫(yī)院管理學會第十屆全國醫(yī)院感染管理學術年會論文匯編[C];2003年

6 馬麗娜;林抗美;杜文琴;官雪芳;劉建;劉波;;不同溫度條件對陰溝腸桿菌降解樂果的降解力的影響[A];中國環(huán)境科學學會2006年學術年會優(yōu)秀論文集（下卷）[C];2006年

7 趙永新;王俠;王輝;張鐵漢;;陰溝腸桿菌產B-內酰胺酶基因型分析[A];中華醫(yī)學會第七次全國中青年檢驗醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2012年

8 王鳳霞;胡志東;田彬;李靜;楊華;周斌;胡yN明;;2008-2011年臨床感染患者陰溝腸桿菌耐藥基因檢測及同源性分析[A];中華醫(yī)學會第七次全國中青年檢驗醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2012年

9 邢嘉翌;;521株陰溝腸桿菌標本分布及耐藥分析[A];第一次全國中西醫(yī)結合檢驗醫(yī)學學術會議暨中國中西醫(yī)結合學會檢驗醫(yī)學專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2014年

10 蘇東;鄧詩琳;張學英;李鍵;劉金偉;;燒傷感染陰溝腸桿菌分型的研究和意義[A];中華醫(yī)學會第六屆全國燒傷外科學術會議論文匯編[C];2001年

相關重要報紙文章 前1條

1 王鵬 記者 王春;我科學家發(fā)現(xiàn)肥胖直接“元兇”陰溝腸桿菌[N];科技日報;2012年

相關博士學位論文 前4條

1 趙金秋;產NDM-1陰溝腸桿菌E.Cloacae 413的耐藥性及致病性研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

2 周志慧;陰溝腸桿菌β-內酰胺酶編碼基因及調控研究[D];浙江大學;2003年

3 趙旭;陰溝腸桿菌質粒介導耐藥機制的研究[D];復旦大學;2010年

4 李愛民;高產AmpC酶和ESBLs酶陰溝腸桿菌多重耐藥分子機制的研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2008年

相關碩士學位論文 前10條

1 朱景松;一種八寶粥軟罐頭中致腐微生物的分離鑒定及與控制相關的特性研究[D];河北農業(yè)大學;2015年

2 李美;陰溝腸桿菌耐藥性分析與產β-內酰胺酶及質粒介導基因型檢測研究[D];貴陽醫(yī)學院;2015年

3 葉青;耐碳青霉烯類抗菌藥物的陰溝腸桿菌耐藥機制及耐藥傳播機制的研究[D];浙江大學;2012年

4 王正蘭;山西太原部分醫(yī)院陰溝腸桿菌的耐藥特征及基因分析[D];山西醫(yī)科大學;2012年

5 王鳳霞;臨床感染患者陰溝腸桿菌對抗菌藥物敏感性分析及其耐藥機制研究[D];天津醫(yī)科大學;2012年

6 李春麗;寧波沿海陸源排污口陰溝腸桿菌鐵代謝相關基因功能研究[D];寧波大學;2013年

7 程玉謙;陰溝腸桿菌臨床株對三代頭孢菌素耐藥機制及I類整合子介導的耐藥性播散的研究[D];天津醫(yī)科大學;2004年

8 劉剛;臨床分離陰溝腸桿菌產ESBLs特性及DRz抑制β-內酰胺酶基因表達的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2006年

9 李彬;產氣腸桿菌（E.aerogenes）和陰溝腸桿菌（E.cloacae）產生物胺作用的研究[D];南京農業(yè)大學;2011年

10 覃曉麗;陰溝腸桿菌嗜鹽α-淀粉酶的基因克隆、表達及嗜鹽特性研究[D];廣西大學;2014年

，

本文編號：2390891