【摘要】：研究背景與目的標記免疫學,就是將標記技術(shù)和免疫學技術(shù)相結(jié)合進行分析測定的一門學科,是集基礎(chǔ)醫(yī)學、實驗技術(shù)和臨床應用于一體的學科,其基本原理是通過熒光素、酶、放射性核素或化學發(fā)光物質(zhì)等標記抗體或抗原,將抗原抗體反應的高度特異性與各標記物的高靈敏、可測量性相結(jié)合,以檢查體內(nèi)各種生物活性物質(zhì)的活性和濃度。常用的標記免疫學分析方法包括免疫熒光、酶免疫測定、免疫組化、放射免疫測定、化學發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫等。隨著標記技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展與完善,標記免疫學已廣泛應用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、環(huán)境及食品檢測等多個領(lǐng)域。根據(jù)抗原抗體反應時,待測物是否均勻分散在液相體系中,可以將免疫分析技術(shù)分為均相免疫分析和非均相免疫分析。當中,常用的均相免疫分析方法有AlphaScreen、TRACE、 LANCE。目前國內(nèi)外廣泛應用于臨床的免疫診斷主要是傳統(tǒng)的非均相分析,例如ELISA、快速試紙條法等。一般而言,傳統(tǒng)非均相分析的操作步驟繁瑣、免疫反應體系緩慢、需要通過洗滌來分離結(jié)合的與未結(jié)合的抗原或抗體、耗費時間長、不易自動化等缺點。與之相比,均相免疫分析技術(shù)因為省卻了洗滌的步驟,可以減少操作帶來的誤差,通常具有靈敏度高、背景熒光值低、信噪比高、應用范圍廣、性質(zhì)穩(wěn)定、便于操作、易于微型化自動化等優(yōu)點。甲胎蛋白(a-fetoprotein, AFP)又稱甲種胎兒球蛋白,人類的甲胎蛋白是由4號染色體長臂的AFP基因所編碼的一種單鏈多肽糖蛋白。甲胎蛋白是主要在胎兒發(fā)育過程中,由卵黃囊和肝臟分泌,并經(jīng)由腎臟排入尿液和羊水,并通過胎盤進入母體血液之中的白蛋白。甲胎蛋白的濃度峰值出現(xiàn)在胎兒時期,之后在8至12個月逐漸降低,并降至健康成人水平。正常情況下,甲胎蛋白濃度維持在低水平。如果母體血清或羊水中甲胎蛋白的濃度異常,提示胎兒可能發(fā)育異常,比如神經(jīng)管缺損、腸道閉鎖、先天性腎病變、胎兒窘迫、死胎等。因此,雖然甲胎蛋白是一項非特異性指標,但母體血清或羊水的中甲胎蛋白濃度依然可以作為胎兒畸形的篩選指標。臨床上還常聯(lián)合其他檢測指標,將其應用于出生缺陷的產(chǎn)前篩查和診斷,以期對疾病實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早干預,有助于減少死亡率、提高存活率和大力普及優(yōu)生優(yōu)育。另外,由于肝細胞癌、卵黃囊和胚胎性腫瘤及部分肝外腫瘤患者可重新合成甲胎蛋白,諸多肝病皆可以伴有甲胎蛋白濃度的升高,因此甲胎蛋白常用于原發(fā)性肝癌或是其他非肝癌惡性腫瘤,包括消化、呼吸、泌尿生殖等多系統(tǒng)器官惡性腫瘤的臨床輔助檢測指標。其次,甲胎蛋白還常用于肝炎、肝硬化等急慢性肝病診斷、病理變化和病程預后的監(jiān)測。量子點(Quantum Dots, QDs)是一種把粒子在三個空間方向上限制束縛住的具有量子限域效應的半導體納米結(jié)構(gòu)材料。它具有較寬激發(fā)譜、窄而對稱的發(fā)射峰、抗光漂白性、Stokes位移大、較高量子產(chǎn)率、摩爾消光系數(shù)大等諸多光學特性,使之有望成為新型的熒光標記物用于現(xiàn)代均相免疫分析技術(shù)中。氧通道技術(shù)(Luminescent oxygen channeling assay, LOCI)是均相免疫分析方法的一種,其特點是感光微球被激發(fā)光激發(fā)后的,能把周邊溶液中的氧分子變成高能的單線態(tài)氧,并以此為載體進行信號傳遞,與傳統(tǒng)的非均相免疫分析相比,省去洗滌的步驟,能有更高的靈敏度。研究內(nèi)容與方法本文旨在利用脂溶性的半導體量子點納米材料,構(gòu)建功能性發(fā)光微球,結(jié)合高能氧通道技術(shù),在熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理下,以甲胎蛋白為例,建立一種新型的基于量子點的高能氧通道均相熒光免疫分析方法并探索其初步應用。主要的研究工作包括以下幾個方面：1.發(fā)光微球的構(gòu)建與表面化學修飾：本研究通過化學溶劑生長法合成出具有核／殼結(jié)構(gòu)的硒化鎘／硫化鋅脂溶性量子點和能接收單線態(tài)氧的噻嗪化合物1-苯胺基,2-苯基氧硫雜環(huán)己烯(N,N-dimethyl-4-(2-phenyl-5,6-dihydro-1,4-oxathiin-3-yl)benzenamine, thioxene).然后通過有機溶劑溶脹法,把量子點、噻嗪化合物和天線材料9,10-雙(苯乙炔基)蒽(9,10-Bis (phenylethynyl) anthracene, BPEA)包埋在羧基化聚苯乙烯微球里,構(gòu)建量子點發(fā)光微球,并通過化學修飾降低其表面非特異性吸附,同時在交聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide, EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide, Sulfo-NHS)的作用下把抗甲胎蛋白的一株單克隆抗體E014,通過羧基與氨基的脫水縮合成肽反應,將其偶聯(lián)在發(fā)光微球表面,構(gòu)建功能性量子點發(fā)光微球。2.感光微球的構(gòu)建與表面修飾：本研究合成光敏性材料BTHS酞青化合物(二(三己基硅氧基)-2,9,16,23-四正丁基-29,31-二氫酞青-硅烷),并通過熱溶脹法包埋在聚苯乙烯微球內(nèi),構(gòu)建成感光微球。然后同樣對感光微球表面進行化學修飾以降低其非特異吸附性,并在EDC、Sulfo-NHS的作用下與鏈霉親和素(Streptavidin, Sav)相偶聯(lián),構(gòu)建功能性感光微球。3.免疫檢測：用生物素標記抗甲胎蛋白的另一株單克隆抗體E010,通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng),雙抗體夾心法,熒光共振能量轉(zhuǎn)移,構(gòu)建免疫檢測方法。用標準品緩沖液將AFP抗原配制成0 IU/mL.1 IU/mL、10 IU/mL、100 IU/mL、500 IU/mL、1000 IU/mL系列濃度,用分析緩沖液把功能性感光微球、發(fā)光微球的濃度調(diào)整為0.1 mg/mL。用生物素標記AFP的另一株單克隆抗體E010,并調(diào)整濃度為5 μg/mL。把25μL的發(fā)光微球、AFP抗原、生物素化抗體混合,37℃震蕩孵育15分鐘后,避光,加入175 μL感光微球,37℃繼續(xù)孵育15分鐘后,用680nm的光源激發(fā)感光微球,檢測605nm處的熒光信號強度。并以自制試劑中參考標準品濃度的對數(shù)為橫坐標,信號值1×103計數(shù)的對數(shù)為縱坐標,由雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理后繪制標準曲線。4.實驗的優(yōu)化：具體包括發(fā)光微球包埋條件的優(yōu)化、發(fā)光微球選用天線材料的優(yōu)化、發(fā)光微球上樣量、免疫反應時間的優(yōu)化等。研究結(jié)果采用雙抗體夾心法,兩株單克隆抗體與AFP抗原形成抗原抗體免疫復合物,并拉近觀光微球和發(fā)光微球的距離,實現(xiàn)單線態(tài)氧的傳遞,經(jīng)過熒光共振能量轉(zhuǎn)移,使量子點發(fā)射信號熒光。通過檢測量子點的熒光信號,發(fā)現(xiàn)其信號強度與反應體系中AFP抗原濃度呈線性相關(guān),其工作曲線為LogY=2.401+1.052-LogX (R2=0.959,P0.01),分析靈敏度為2.65 IU/mL。該新型均相免疫分析方法不需沖洗掉未結(jié)合的熒光標記物,靈敏度高,可為今后實現(xiàn)快速、多元、高靈敏度、微量化、自動化及高通量化的現(xiàn)代免疫分析技術(shù)提供科學依據(jù)。研究結(jié)論本文通過把量子點溶脹包埋進羧基化聚苯乙烯微球制備而成的發(fā)光微球與抗AFP的一株單克隆抗體偶聯(lián),制備得功能性的發(fā)光微球；合成光敏性的BTHS酞青化合物并包埋進聚苯乙烯微球制得感光微球,并與鏈霉親和素偶聯(lián)；把抗AFP的另一株單克隆抗體與生物素相連后,通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng),建立一種基于量子點的高能氧通道均相熒光免疫分析方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.6

【共引文獻】

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本文編號：2341703